孫麗芳，楊海堂，衛(wèi) 偉*

(1.國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局復(fù)審和無(wú)效審理部，北京 100088；2.東南大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，江蘇 南京 211189)

端粒和端粒酶在保證細(xì)胞分裂時(shí)染色體的完整復(fù)制、免于退化方面起關(guān)鍵作用。端粒酶是染色體的自然脫落物，能引發(fā)衰老和癌癥。在新細(xì)胞中，細(xì)胞每分裂一次，端粒就縮短一次。當(dāng)端粒不能再縮短時(shí)，細(xì)胞即無(wú)法繼續(xù)分裂而死亡。大約90%的癌細(xì)胞都有著不斷增長(zhǎng)的端粒及相對(duì)來(lái)說(shuō)數(shù)量較多的端粒酶[1-2]。大量研究數(shù)據(jù)證明，端粒酶活性在正常體細(xì)胞中被抑制，正常組織細(xì)胞中幾乎檢測(cè)不到端粒酶的活性，但其在腫瘤細(xì)胞中高度表達(dá)，大約90%的癌細(xì)胞如膀胱癌、乳腺癌、胃癌細(xì)胞中可以檢測(cè)到高活性的端粒酶[3]。因此，端粒酶作為一種潛在的腫瘤標(biāo)志物，其檢測(cè)對(duì)癌癥的預(yù)防、早期發(fā)現(xiàn)以及預(yù)后效果的判斷均具有重大意義。

早期的端粒酶活性檢測(cè)方主要有端粒重復(fù)序列擴(kuò)增法(TRAP)[4-6]、端粒重復(fù)序列延伸法[7]、化學(xué)發(fā)光法[8-10]、實(shí)時(shí)定量熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法[11]等。近年發(fā)展起來(lái)的很多新的基于各種納米材料和新技術(shù)的高靈敏檢測(cè)端粒酶活性的方法，如電化學(xué)檢測(cè)法[12-13]、比色法[14]、熒光法[15]、表面增強(qiáng)拉曼光譜法[16]等，為端粒酶的檢測(cè)提供了新選擇。本文重點(diǎn)介紹近年發(fā)展的端粒酶檢測(cè)新方法。

1 電化學(xué)檢測(cè)法

電化學(xué)分析方法作為一種經(jīng)典的分析方法，具有特異性好、操作簡(jiǎn)單、儀器價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)。近年來(lái)，用電化學(xué)分析方法來(lái)檢測(cè)端粒酶活性的工作[12,17-19]被大量報(bào)道。

基于DNA上的磷酸基團(tuán)可與鉬酸鹽反應(yīng)生成有電化學(xué)活性的磷鉬酸鹽，Wang等[12]建立了一種用于端粒酶活性測(cè)定的超靈敏電化學(xué)傳感器。該檢測(cè)體系對(duì)102～107Hela cells/mL的端粒酶活性有線性響應(yīng)，檢測(cè)限為40 Hela cells/mL。Ling等[17]合成了卟啉金屬有機(jī)框架(ProMOF)材料，在表面包裹鏈霉親和素(SA)后得到ProMOF@SA材料，該材料可在接近電極表面時(shí)電催化氧氣發(fā)生還原反應(yīng)，產(chǎn)生電流信號(hào)。該研究通過(guò)端粒酶將其引物擴(kuò)增形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，并釋放與引物互補(bǔ)的DNA，互補(bǔ)DNA與修飾在電極表面的發(fā)卡DNA雜交，發(fā)卡DNA上的生物素通過(guò)與ProMOF@SA結(jié)合，還原氧氣產(chǎn)生電流，從而實(shí)現(xiàn)端粒酶的檢測(cè)。

此外，研究者們還開發(fā)了端粒酶的免標(biāo)記電化學(xué)檢測(cè)方法。例如，Liu等建立了一種基于T7核酸外切酶輔助靶循環(huán)的均相、靈敏、快速、簡(jiǎn)便的電化學(xué)策略，用于癌細(xì)胞中端粒酶活性的檢測(cè)[18]。無(wú)端粒酶時(shí)，標(biāo)記有亞甲基藍(lán)(MB)的發(fā)卡DNA遠(yuǎn)離電極表面，MB的電流信號(hào)較弱；有端粒酶時(shí)，端粒酶擴(kuò)增產(chǎn)物與發(fā)卡DNA形成互補(bǔ)雙鏈，T7核酸外切酶切割雙鏈DNA，此時(shí)由于正負(fù)電吸引作用，MB靠近電極表面。該方案中，端粒酶引物可以循環(huán)利用，提高了檢測(cè)的靈敏度。Wei等也發(fā)展了一系列免標(biāo)記電化學(xué)檢測(cè)端粒酶活性的新方法。他們以DNA正四面探針固定端粒擴(kuò)增引物并將其修飾到金電極表面，端粒酶擴(kuò)增出(TTAGGG)n富G序列形成G-四鏈體后，具有過(guò)氧化物類催化活性，可催化苯胺聚合，形成具有電化學(xué)活性的聚苯胺，進(jìn)而可通過(guò)示差脈沖伏安法檢測(cè)聚苯胺的電化學(xué)信號(hào)來(lái)檢測(cè)端粒酶活性。該法最低檢測(cè)限為1個(gè)細(xì)胞/10 μL，與單鏈端粒引物探針相比，信號(hào)強(qiáng)度提高20倍[20]。此外，他們還設(shè)計(jì)了一種基于氧化鋁納米通道的無(wú)標(biāo)記端粒酶活性檢測(cè)新方法[21]，以及無(wú)標(biāo)記、無(wú)電極修飾的檢測(cè)端粒酶活性的新方法[22]。

Zhang 等將聚魯米諾-鉑納米(polyluminol-PtNPs)材料修飾在氧化銦錫(ITO)電極表面，利用端粒酶引入修飾的DNA@MSN@PMA作探針，采用電致化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)了細(xì)胞內(nèi)端粒酶的活性[23]。Feng等利用硫化鎘半導(dǎo)體納米材料(CdS NCs)和魯米諾-金納米復(fù)合材料(L-AuNPs)間的能量轉(zhuǎn)移(ECL-RET)，實(shí)現(xiàn)了端粒酶的活性檢測(cè)[24]。Xiong等合成了釕摻雜的金屬有機(jī)骨架，并利用ECL-RET原理實(shí)現(xiàn)了端粒酶的檢測(cè)[25]。

2 比色法檢測(cè)端粒酶活性

與電化學(xué)檢測(cè)相比，比色法通過(guò)裸眼觀察溶液顏色及其深淺來(lái)判斷有無(wú)目標(biāo)物和目標(biāo)物含量，是一種直觀、簡(jiǎn)便、易于快速操作的分析檢測(cè)方法。與其它分析檢測(cè)方法相比，比色法不需要借助于昂貴的儀器，對(duì)操作人員的技術(shù)要求不高，因此越來(lái)越受到人們的關(guān)注[26-27]。

在K+與hemin的存在下，端粒酶在引物3′端擴(kuò)增出的富含G的DNA序列會(huì)形成hemin-G-四鏈體納米結(jié)構(gòu)，該納米結(jié)構(gòu)具備辣根過(guò)氧化物酶催化活性。Freeman等將制備得到的hemin-G-四鏈體用于催化3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，端粒酶含量越多，得到的TMB+越多，進(jìn)而可通過(guò)TMB紫外吸收值的變化實(shí)現(xiàn)端粒酶的檢測(cè)，其最低檢測(cè)限為200 cells/μL[26]。納米金(AuNPs)是一種很好的比色法探針，當(dāng)AuNPs之間距離很遠(yuǎn)時(shí)，溶液呈紅色；當(dāng)AuNPs距離靠近時(shí)，其紫外吸收峰發(fā)生紅移，溶液變成藍(lán)色。Willner等基于左旋半胱氨酸(L-Cysteine)的輔助作用，通過(guò)端粒酶擴(kuò)增引物(TS)擴(kuò)增后形成的hemin-G-四鏈體控制AuNPs的聚集和分散，并實(shí)現(xiàn)了端粒酶活性的檢測(cè)[27]。Wang等也提出了利用TS修飾AuNPs比色法檢測(cè)端粒酶活性的方法[28]。Xia等以雙功能化的金膠為探針，發(fā)現(xiàn)當(dāng)膀胱癌患者尿液中端粒酶活性水平不同時(shí)，該探針可呈現(xiàn)出4種不同的狀態(tài)(藍(lán)色、紫色、紅色及沉淀)[29]。

Wei等研究了hemin復(fù)合的石墨烯(H-GNs)、金納米棒等納米材料在端粒酶檢測(cè)中的應(yīng)用。H-GNs在鹽溶液中具有可調(diào)控的分散性和類過(guò)氧化氫酶活性。端粒酶活性不同時(shí)，H-GNs團(tuán)聚程度不同，因而催化TMB的顯色程度不同，所以可以通過(guò)肉眼觀察溶液顏色的變化來(lái)判斷端粒酶含量[30]。他們還提出了一種基于hemin-G-四鏈體類過(guò)氧化物酶催化刻蝕金納米棒的方法來(lái)比色檢測(cè)端粒酶：以金納米棒(GNRs)為探針，端粒酶活性不同，金納米棒被刻蝕的程度不同，其溶液呈現(xiàn)紅、灰、藍(lán)、紫、粉紅等顏色，基于此可實(shí)現(xiàn)對(duì)端粒酶的快速、簡(jiǎn)單、可視化檢測(cè)[31]。

3 熒光法檢測(cè)端粒酶活性

熒光法是生物分析中的常用方法，該法可將待測(cè)物質(zhì)的有無(wú)和含量多少通過(guò)熒光信號(hào)輸出的分子光譜峰位置以及強(qiáng)度表示出來(lái)。與一般檢測(cè)方法相比，熒光法具有靈敏度高、能夠?qū)崟r(shí)原位檢測(cè)以及可生物成像等[32-39]等優(yōu)勢(shì)。

國(guó)內(nèi)外有不少利用熒光法檢測(cè)端粒酶活性的研究。Ma等設(shè)計(jì)了能特異性識(shí)別端粒酶，同時(shí)又能夠釋放出廣譜抗腫瘤藥物阿霉素(Dox)的熒光探針，基于此建立的檢測(cè)平臺(tái)能夠?qū)崿F(xiàn)端粒酶活性檢測(cè)、細(xì)胞成像以及腫瘤治療的一體化[32]。Yang等設(shè)計(jì)了一種基于熒光能量共振轉(zhuǎn)移(FRET)原理的探針，用于細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性檢測(cè)和細(xì)胞成像研究[34]。他們將修飾有異硫氰酸熒光素(FITC)和四甲基羅丹明(TAMRA)的DNA(該DNA命名為 Flare)作為探針，當(dāng)探針進(jìn)入到含有端粒酶的細(xì)胞中時(shí)，延伸出來(lái)的序列將Flare置換出去，形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，F(xiàn)lare離開AuNPs表面。此時(shí)FITC和TAMRA距離很近，且沒有AuNPs的猝滅作用，使得TAMRA熒光信號(hào)大大增強(qiáng)。Ma等發(fā)展了一種基于2-氨基嘌呤無(wú)猝滅分子信標(biāo)檢測(cè)端粒酶活性的方法。當(dāng)端粒酶引物被擴(kuò)增后，隨著大片段(KF)聚合酶的加入，引物沿著模板延伸，與加入的發(fā)卡DNA形成雙鏈，同時(shí)分子信標(biāo)被T7酶降解，釋放出游離的分子信標(biāo)和引物延伸鏈，引發(fā)下一輪T7外切酶降解。該方法實(shí)現(xiàn)了雙重信號(hào)放大，具有高靈敏度和特異性，在抗腫瘤藥物的開發(fā)方面具有重要意義[35]。

還有一些科學(xué)家設(shè)計(jì)了更為巧妙的免標(biāo)記法檢測(cè)端粒酶的活性。Zhou等開發(fā)了一種基于構(gòu)象開關(guān)的端粒酶活性的熒光檢測(cè)方法。該法通過(guò)使擴(kuò)增產(chǎn)物與無(wú)活性的適體分子(Spinach)雜交，觸發(fā)適體的構(gòu)象轉(zhuǎn)換，隨后Spinach與熒光分子結(jié)合，產(chǎn)生綠色熒光，通過(guò)加入核糖核酸酶(RNase H)將雜交的雙鏈切掉，釋放端粒酶擴(kuò)增產(chǎn)物，如此循環(huán)利用，可使熒光信號(hào)得到進(jìn)一步增強(qiáng)。該熒光生物傳感器的檢測(cè)限為100個(gè)細(xì)胞[39]。此外，Wei等提出了基于TOTO-1對(duì)單鏈DNA中G堿基的高靈敏度和高選擇性檢測(cè)端粒酶的方法，通過(guò)引入ExoⅢ核酸外切酶對(duì)引物鏈消化，極大地提高了方法的靈敏度。該方法對(duì)端粒酶的檢測(cè)范圍為2～4 000 cells/mL，最低檢測(cè)限為2 cells/mL[40]。

在熒光檢測(cè)法中，原位檢測(cè)技術(shù)能夠在活細(xì)胞內(nèi)研究癌癥標(biāo)志物的動(dòng)態(tài)，分析其表達(dá)的機(jī)會(huì)及表達(dá)水平，實(shí)現(xiàn)癌癥標(biāo)志物的快速、靈敏檢測(cè)。目前許多研究將納米材料與信號(hào)放大技術(shù)結(jié)合形成納米探針，并以胞吞的形式進(jìn)入細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的原位檢測(cè)。如Qian等設(shè)計(jì)了對(duì)端粒酶響應(yīng)的介孔硅納米粒子(MSN)探針，并實(shí)現(xiàn)了端粒酶活性的高靈敏檢測(cè)以及細(xì)胞成像研究[41]。他們?cè)趲д姾傻腗SN孔道上修飾熒光猝滅基團(tuán)2,5-二特丁基對(duì)苯二酚(BHQ)和帶正電荷的熒光素，并用DNA鏈對(duì)MSN孔道進(jìn)行封堵。端粒酶擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)和封堵DNA雜交，使之從MSN表面脫落，釋放熒光素，產(chǎn)生熒光，該方法可用于細(xì)胞成像。此外，Zhuang等利用聚集誘導(dǎo)發(fā)光(AIE)的特性，開發(fā)了一種快速靈敏的生物探針，利用端粒酶將引物擴(kuò)增后形成的帶高密度負(fù)電荷的單鏈DNA，引起AIE分子的聚集誘導(dǎo)發(fā)光，并將其用于細(xì)胞內(nèi)原位成像來(lái)檢測(cè)端粒酶活性[42]。

4 表面增強(qiáng)拉曼光譜法

表面增強(qiáng)拉曼法光譜(SERS)具有檢測(cè)限低、特異性好、操作簡(jiǎn)便、待測(cè)樣品狀態(tài)不受限制等特點(diǎn)，在生化分析領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[43-44]。

Xu等以AuNPs為材料進(jìn)行DNA自組裝，合成了金字塔型的拉曼探針用于端粒酶活性的檢測(cè)和細(xì)胞成像[43]。他們?cè)?個(gè)15 nm左右的AuNPs表面修飾上4條DNA單鏈，并將其和Cy5標(biāo)記的指示探針(RS)以及端粒酶引物(TS)互補(bǔ)配對(duì)，組成具有拉曼信號(hào)的檢測(cè)探針。端粒酶擴(kuò)增產(chǎn)物可使RS從雙鏈上脫落，拉曼信號(hào)消失。將該探針與含有端粒酶的癌細(xì)胞進(jìn)行孵育，由于AuNPs具有良好的生物相容性并且能夠進(jìn)入細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生熒光信號(hào)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)了端粒酶的細(xì)胞成像研究。

Eom等構(gòu)建了基于納米孔道金納米線(AuNW)SERS檢測(cè)器檢測(cè)癌細(xì)胞和組織中端粒酶活性的平臺(tái)[44]。通過(guò)在AuNW上濺射沉積Au獲得富含納米空孔道的AuNW，AuNW具有穩(wěn)定的拉曼信號(hào)，而MB是一種可以嵌入G-四鏈體結(jié)構(gòu)的具有拉曼增強(qiáng)效應(yīng)的分子。當(dāng)端粒酶擴(kuò)增的富G序列形成G-四鏈體后，正電性的MB分子嵌入G-四鏈體內(nèi)，增強(qiáng)富含納米孔道AuNW的拉曼信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)癌細(xì)胞和癌癥組織中端粒酶活性的檢測(cè)。該方法非常靈敏，最低檢測(cè)限可達(dá)0.2個(gè)癌細(xì)胞。

5 局域表面等離子體共振技術(shù)

免標(biāo)記的局域表面等離子共振(LSPR)檢測(cè)技術(shù)具有很高的時(shí)空分辨率，能夠進(jìn)行單顆粒水平原位生物過(guò)程及化學(xué)反應(yīng)的研究[45-49]。

Liu等建立了基于等離子體共振散射光譜和暗場(chǎng)顯微鏡原位檢測(cè)端粒酶活性及細(xì)胞成像的方法。他們利用端粒酶引物將50 nm的金(核)和13 nm的金(衛(wèi)星)組裝制得Au50@Au13復(fù)合探針，該探針在暗場(chǎng)顯微鏡下呈橙色。當(dāng)引物被端粒酶擴(kuò)增后，擴(kuò)增產(chǎn)物雜交形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，Au50@Au13探針發(fā)生去組裝，探針發(fā)生顯著LSPR位移，散射光由橙色向綠色漸變。該設(shè)計(jì)極大提高了單粒子的檢測(cè)靈敏度，檢出限低至1.3×10-13IU，可監(jiān)測(cè)藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性變化[50]。

6 結(jié)論與展望

端粒酶是重要的腫瘤生物標(biāo)志物之一，實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確的端粒酶活性評(píng)價(jià)是本領(lǐng)域研究者孜孜不倦的追求。最近幾年，端粒酶活性的檢測(cè)新方法已經(jīng)克服了原位端粒酶活性檢測(cè)的挑戰(zhàn)，實(shí)現(xiàn)了從體外到活細(xì)胞內(nèi)端粒酶成像的檢測(cè)。盡管方法的高靈敏度和方便快捷性尚未能很好的兼顧，穩(wěn)定性方面也有待改進(jìn)，這些方法也還不能直接用于臨床診斷和癌癥患者的藥物治療效果監(jiān)測(cè)。然而熒光技術(shù)對(duì)端粒酶在活細(xì)胞中的內(nèi)成像做出了巨大貢獻(xiàn)，可以預(yù)期，一些DNA組裝的納米探針，如AuNP/DNA和PtNPs/DNA在抗癌藥物從體外運(yùn)輸進(jìn)入體內(nèi)方面具有巨大的潛力，實(shí)現(xiàn)端粒酶監(jiān)測(cè)、腫瘤治療與熒光成像一體仍有很大的研究空間。因此，發(fā)展對(duì)端粒酶活性分析的簡(jiǎn)單、靈敏、低成本的原位實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)仍然是當(dāng)前亟待解決的問題。