于 湛, 李天樂, 韓東旭, 劉麗艷, 陳慶陽, 蘇桂田

(1. 沈陽師范大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院, 沈陽 110034; 2. 沈陽師范大學(xué) 復(fù)雜體系分離與分析遼寧省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 沈陽 110034)

環(huán)糊精(Cyclodextrins,CD)是由數(shù)個(gè)葡萄糖殘基由α-1,4糖苷鍵連接而成的天然環(huán)式低聚糖。CD的外形呈上窄下寬,兩端開口中空的結(jié)構(gòu)。由于其具有“內(nèi)腔疏水,外部親水”的特性,可作為主體與一些形狀、極性、大小等方面相匹配的客體藥物形成包合物,從而提高客體藥物的溶解性、穩(wěn)定性以及生物利用度[1]。天然環(huán)糊精由于存在較強(qiáng)的分子內(nèi)氫鍵作用,水溶性并不很理想[2],因此需要在保證骨架不變的情況下通過化學(xué)方法引入取代基對(duì)其進(jìn)行修飾,修飾后的環(huán)糊精如2,6-二甲基-β-環(huán)糊精(DM-β-CD)、2-羥丙基-β-環(huán)糊精(2HP-β-CD)等,保留了疏水空腔的同時(shí)又提高了水溶性,成為了近幾年來醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域關(guān)注的重點(diǎn),具有更好的研究與應(yīng)用前景[3-6]。

大豆苷元(Daidzein,Dai)(圖1)是一種從大豆中提取出來與雌激素相似作用的化合物[7],具有擴(kuò)張血管、增加冠脈流量和降低血壓的作用[8],對(duì)于骨質(zhì)疏松、前列腺炎以及II型糖尿病[9]有良好的防治效果同時(shí)也廣泛應(yīng)用于婦女更年期綜合癥的治療[10]。但是由于Dai本身不溶于水致使其生物利用度比較低,在研究上往往只能配制成懸濁液使用,極大地限制了其在臨床上的應(yīng)用范圍。通常情況下可采用化學(xué)修飾法、酶法糖基化修飾、表面活性劑等方法去提高此類難溶性藥物的水溶性,但出于安全、生產(chǎn)成本等因素的考慮,導(dǎo)致上述方法在生產(chǎn)生活的應(yīng)用中受到了限制。因此,尋找一種高效的提高Dai水溶性的方法,在醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域具有重大的意義。

圖1 文中所用各種CD(A)與Dai(B)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of CDs(A) and dai(B)

本文使用β-環(huán)糊精(β-CD)、γ-環(huán)糊精(γ-CD)以及3種β-CD衍生物-2-羥丙基-β-環(huán)糊精(2HP-β-CD)、2,6-二甲基-β-環(huán)糊精(DM-β-CD)和6-葡萄糖基-β-環(huán)糊精(6Glu-β-CD)為增溶劑,通過形成可溶性復(fù)合物方式研究了其對(duì)Dai的增溶效果,并通過傅里葉變換紅外光譜法、熱重分析法、X射線粉末衍射法等手段表征了所形成的CD-Dai復(fù)合物。本文研究結(jié)果表明DM-β-CD是一種有效的Dai增溶劑,可為Dai的后期研究與應(yīng)用提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

UH-5300紫外-可見分光光度計(jì)(日本日立公司);NICOLET-380型傅里葉變換紅外光譜儀(美國熱電公司);THZ-82超聲波清洗儀(常州國華公司);Ultima Ⅳ型X射線粉末衍射儀(日本理學(xué)公司)

本文所使用藥品與溶劑均為分析純或更高。Dai購自西安開來生物有限公司,β-CD、γ-CD、2HP-β-CD、DM-β-CD和6Glu-β-CD購自上海源葉生物科技有限公司,實(shí)驗(yàn)用水為二次去離子水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 相溶解度法

精確稱取6份質(zhì)量相同的Dai(1.0 mg)于一次性離心管中,向其中分別加入不同體積的CD儲(chǔ)液,隨后加水至10 mL,使其中的CD濃度分別為0、2×10-3、4×10-3、6×10-3、8×10-3和1×10-2mol/L,然后超聲振蕩30 min后高速離心15 min,使用0.22 μm微孔濾膜過濾上層清液,測其在249 nm(λmax)處的吸光度。

1.2.2 傅里葉變換紅外光譜法

使用研磨法[11]制備DM-β-CD-Dai復(fù)合物與物理混合物。取適量DM-β-CD置于研缽中,加入1∶1物質(zhì)的量的Dai,充分研磨1 h后干燥至恒重,可得DM-β-CD-Dai復(fù)合物。將DM-β-CD與Dai按物質(zhì)的量1∶1混合、共同研磨1 min,使其混合均勻,可得物理混合物。

1.2.3 X射線粉末衍射法

對(duì)DM-β-CD、Dai、復(fù)合物與物理混合物進(jìn)行X射線粉末衍射儀分析。分析條件如下:室溫,Cu靶Kα射線,波長0.154 187 nm,掃描電壓40 kV,管電流40 mA,掃描速度(2θ)為1°/min,采樣間隔為0.02°,掃描范圍為5°～30°。

1.2.4 分子對(duì)接與分子動(dòng)力學(xué)研究

本文使用Autodock 4.2研究DM-β-CD與Dai的分子對(duì)接結(jié)果,推測復(fù)合物的結(jié)構(gòu)。Autodock程序設(shè)置如下:立方體格子長寬高均為40 ?,格子間隔為0.375 ?,LGA算法的ga_pop_size為150,ga_num_evals為2 500 000,ga_num_generations為27 000,ga_run為50,其余參數(shù)均采用默認(rèn)值。

本文使用Schrodinger公司Maestro軟件包(2016.04)中Desmond模塊對(duì)能量最低的對(duì)接結(jié)果進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性評(píng)價(jià)。對(duì)接結(jié)果首先導(dǎo)入一個(gè)邊長為10 ?的立方體箱子中,水分子使用TIP3P模式,由于DM-β-CD與Dai均不帶電荷,因此體系中均不加入任何抗衡離子。隨后使用Desmond默認(rèn)參數(shù)設(shè)置程序?qū)崿F(xiàn)體系能量最小化和體系弛豫過程,采用NPT系綜,溫度為300 K,壓力為1.013 25 bar,溫度控制采用Nose-Hoover耦合方法,弛豫時(shí)間為1 ps,壓力控制采用Martyna-Tobias-Klein方法,弛豫時(shí)間為2 ps,采用各向同性壓強(qiáng)耦合,模擬積分步長設(shè)置為2 fs;經(jīng)過2 ns的平衡后,進(jìn)行30 ns的分子動(dòng)力學(xué)模擬。

2 結(jié)果與討論

2.1 相溶解度法分析

圖2 多種CD存在條件下Dai的相溶解度曲線Fig.2 Phase solubility curves of Dai in aqueous solution with the existence of various CDs

圖2給出了不同CD存在對(duì)Dai的相溶解度結(jié)果。由圖可見,隨著CD濃度的增加,Dai在249 nm(λmax)處吸光度隨之明顯增強(qiáng),在CD濃度為0～1×10-2mol/L范圍內(nèi),Dai的吸光度與各種CD濃度之間均存在線性關(guān)系,線性方程與相關(guān)系數(shù)R2見表1。由圖2可以清楚地看出,β-CD及各種衍生物均可有效増溶Dai,尤其是DM-β-CD具有最大的增溶作用。

根據(jù)Higuchi和Connors理論[12]可知, 圖2中相溶解度曲線均為AL型,溶液中存在1∶1型可溶性CD/Dai復(fù)合物。 根據(jù)公式K=斜率/(S0×(1-斜率))可計(jì)算出復(fù)合物的結(jié)合常數(shù), 其中S0為Dai在水中溶解度, 斜率為圖1中擬合直線斜率。 表1給出了對(duì)圖2中數(shù)據(jù)計(jì)算結(jié)果, 比較可知DM-β-CD/Dai復(fù)合物的K值最大, 因此DM-β-CD具有對(duì)Dai最大的增溶效果。

說明

2.2 紅外光譜分析

圖3 DM-β-CD/Dai復(fù)合物(a)、DM-β-CD/Dai物理混合物(b)、Dai(c)與DM-β-CD(d)的紅外光譜圖Fig.3 FTIR spectra of DM-β-CD/Dai inclusion complex(a), DM-β-CD/Dai physical mixture(b), Dai(c) and DM-β-CD(d), respectively

圖3給出了DM-β-CD、Dai、物理混合物與復(fù)合物的紅外光譜圖。Dai在1 596 cm-1處的特征吸收峰在物理混合物中可明顯觀察得到,說明在物理混合物中Dai與DM-β-CD只是簡單地混合在一起,而在復(fù)合物中幾近消失,說明二者之間存在明顯相互作用。根據(jù)DM-β-CD與Dai結(jié)構(gòu)特點(diǎn),推測復(fù)合物中Dai的A環(huán)與C環(huán)有可能會(huì)深入DM-β-CD空腔中,使其芳香環(huán)振動(dòng)受到限制,從而影響其紅外吸收。

2.3 X射線粉末衍射分析

圖4 DM-β-CD/Dai復(fù)合物(a)、DM-β-CD/Dai物理混合物(b)、Dai(c)與DM-β-CD(d)的XRD譜圖Fig.4 XRD spectra of DM-β-CD/Dai inclusion complex(a), DM-β-CD/Dai physical mixture(b), Dai(c) and DM-β-CD(d), respectively

圖4給出了DM-β-CD、Dai、物理混合物與復(fù)合物的XRD譜圖。圖中DM-β-CD表現(xiàn)為兩個(gè)寬峰,說明此類物質(zhì)以無定型形式存在,其結(jié)構(gòu)中不存在晶體結(jié)構(gòu)中原子排列的長程有序。Dai表現(xiàn)為一系列強(qiáng)烈的衍射峰,說明Dai具有很好的結(jié)晶狀態(tài)。物理混合物中的譜圖表現(xiàn)為主客體特征衍射峰的疊加,而在復(fù)合物的譜圖中,12.94°、18.98°、22.20°、25.58°和27.26°等處的衍射峰消失,表明復(fù)合物中DM-β-CD與Dai間存在相互作用,使得Dai物相發(fā)生一定程度改變[13]。

圖5 DM-β-CD與Dai能量最低分子對(duì)接結(jié)果Fig.5 The lowest energy molecular docking resultof DM-β-CD and Dai

2.4 分子模擬結(jié)果分析

本文利用分子對(duì)接方法[14]模擬DM-β-CD/Dai復(fù)合物結(jié)構(gòu), 圖5為能量最低的對(duì)接結(jié)果。 Dai分子的A環(huán)與C環(huán)完全深入至DM-β-CD疏水性空腔內(nèi), B環(huán)置于DM-β-CD大口邊緣, Dai的A環(huán)與DM-β-CD的一個(gè)6位O原子之間存在氫鍵作用, 這個(gè)氫鍵對(duì)于復(fù)合物穩(wěn)定性起了一定作用。

為驗(yàn)證分子對(duì)接結(jié)果的可靠性和對(duì)接復(fù)合物的穩(wěn)定性,本文使用分子動(dòng)力學(xué)模擬,分析了對(duì)接復(fù)合物、復(fù)合物中DM-β-CD與Dai的均方根偏差(RMSD)。由圖6可以看出,在30 ns時(shí)間范圍內(nèi),無論是復(fù)合物中DM-β-CD、Dai還是復(fù)合物整體,它們的RMSD值均趨于收斂平衡,這說明表明復(fù)合物的結(jié)構(gòu)具有很強(qiáng)的穩(wěn)定性,表明分子對(duì)接的結(jié)果是可靠的。

(a)—Dai相對(duì)于DM-β-CD; (b)—Dai相對(duì)于其初始結(jié)構(gòu); (c)—DM-β-CD相對(duì)于其初始結(jié)構(gòu)圖6 DM-β-CD/Dai復(fù)合物的30 ns分子動(dòng)力學(xué)模擬的RMSD結(jié)果Fig.6 RMSD mapped over a 30 ns MD trajectory of the DM-β-CD/Dai complex

3 結(jié) 論

本文采用相溶解度法研究了各種CD對(duì)Dai的增溶作用,結(jié)果表明DM-β-CD具有最大的增溶作用,并可與Dai形成1∶1型復(fù)合物。本文通過FT-IR、XRD等手段驗(yàn)證了復(fù)合物的存在,并采用分子對(duì)接技術(shù)推測了可能的復(fù)合物結(jié)構(gòu),并利用分子動(dòng)力學(xué)驗(yàn)證了對(duì)接結(jié)果的穩(wěn)定性。本文的研究結(jié)果表明DM-β-CD對(duì)Dai具有很好的增溶作用,并且所形成的復(fù)合物具有極好的穩(wěn)定性,而且由于DM-β-CD毒性低[15],可作為載體使用,提高Dai的生物利用度。