郝飛飛，王天成，張 黎，彌成龍，馮玉萍，張雪松，鄭明學(xué)

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，山西 太谷 030801)

雞球蟲病是由于艾美耳球蟲寄生于雞腸道內(nèi)所引起的一種危害極嚴(yán)重的全球性寄生蟲病[1-2]，我國(guó)將其列為二類動(dòng)物疫病。雞感染球蟲后一般表現(xiàn)為慢性經(jīng)過，發(fā)病期間飼料轉(zhuǎn)化率降低且雞生長(zhǎng)緩慢，給肉雞體質(zhì)量的增加造成了嚴(yán)重威脅；但若表現(xiàn)為急性感染，雞的死亡率則高達(dá)80%[3]。目前，給我國(guó)傳統(tǒng)養(yǎng)雞業(yè)造成嚴(yán)重危害的球蟲包括雞柔嫩艾美耳球蟲(E.tenella)、毒害艾美耳球蟲(E.nectrix)、堆形艾美耳球蟲(E.acervulina)和巨型艾美耳球蟲(E.maxima)。其中，雞E.maxima病流行性廣，且對(duì)雞的生長(zhǎng)和體質(zhì)量的增加影響嚴(yán)重，感染后雞的相對(duì)體質(zhì)量增加率可下降50%以上[4]。我國(guó)是養(yǎng)雞大國(guó)，每年用于抗球蟲藥物的花費(fèi)約為雞病全部防治費(fèi)用的30%，且這一數(shù)據(jù)還在持續(xù)上升[5]。

將球蟲活苗制備成疫苗對(duì)雛雞進(jìn)行免疫，是實(shí)際生產(chǎn)中唯一可替代抗球蟲藥物來控制球蟲病的方法[6-7]。目前，商用的雞球蟲疫苗有強(qiáng)毒活疫苗和弱毒活疫苗。由球蟲親本株制備的強(qiáng)毒活疫苗雖然免疫效果良好，但使用不當(dāng)易導(dǎo)致免疫失敗，甚至導(dǎo)致雞場(chǎng)暴發(fā)球蟲?。欢汕蛳x親本株選育出的早熟株是全世界公認(rèn)的免疫原性好、致病力低且遺傳穩(wěn)定的球蟲疫苗蟲株[8]，由其制備的弱毒活疫苗在世界范圍內(nèi)被廣泛使用。山西農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)病理實(shí)驗(yàn)室前期已從雞E.acervulina、E.nectrix、E.tenella的親本株中成功選育出其各自的早熟株，球蟲多價(jià)弱毒苗的制備還缺少E.maxima早熟株。在疫苗中添加E.maxima早熟株能夠增加其免疫原性，同時(shí)配合基因佐劑加強(qiáng)免疫能夠縮短免疫空窗期，降低疫苗副作用，從而對(duì)雞球蟲病起到更好的預(yù)防效果。因此，本研究選用由山東分離出的雞E.maxima進(jìn)行早熟株選育，旨在為球蟲多價(jià)苗提供E.maxima早熟株蟲種并研究其生物學(xué)特性，為防治球蟲病提供相關(guān)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 雞E.maxima親本株與供試動(dòng)物

供試雞E.maxima親本株為山東分離株(潛隱期124 h)，由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)病理實(shí)驗(yàn)室保存與提供。無特定病原(SPF)雛雞由北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 雞E.maxima早熟株的選育 14日齡SPF雛雞(20羽/批)以1.0×104個(gè)/羽的劑量口服接種E.maxima親本株孢子化卵囊，接種后123 h起每小時(shí)檢查1次雞糞便中有無球蟲卵囊。記錄每次接種后最先發(fā)現(xiàn)卵囊的時(shí)間。由此開始，連續(xù)收集10 h雞糞便中的卵囊，在體外培養(yǎng)成熟后繼續(xù)接種下一批雛雞。連續(xù)傳代至蟲株潛隱期時(shí)，則表明成功選育出雞E.maxima早熟株。

1.2.2 雞E.maxima早熟株和親本株潛隱期的卵囊形態(tài)觀察 于14日齡時(shí)對(duì)空腹的SPF雛雞進(jìn)行體質(zhì)量稱量，將42羽體質(zhì)量接近的雛雞隨機(jī)分為2個(gè)組，每組21羽，分別以20.0×104個(gè)/羽的劑量口服接種E.maxima親本株和早熟株孢子化卵囊。接種后以24 h為間隔，在2個(gè)組中分別隨機(jī)挑取3羽雞進(jìn)行剖檢。觀察雞空腸有無肉眼可見的病變，并取空腸中段卵黃蒂附近的腸上皮進(jìn)行組織涂片，同時(shí)對(duì)該部位腸道進(jìn)行取材并制作石蠟切片，經(jīng)HE染色后于光鏡下觀察裂殖體及卵囊出現(xiàn)時(shí)間，以及球蟲卵囊孢子化前的大小。

1.2.3 雞E.maxima早熟株致病性和繁殖力的比較 于14日齡時(shí)對(duì)空腹的SPF雛雞進(jìn)行體質(zhì)量稱量，將110羽體質(zhì)量接近的雛雞隨機(jī)分為11組，每組10羽，其中，5組為親本株接種組，5組為早熟株接種組，分別按照0.1×104、0.5×104、1.0×104、10.0×104、20.0×104個(gè)/羽的劑量梯度口服接種E.maxima親本株和早熟株孢子化卵囊，剩余1組為空白對(duì)照組，每羽雞口服等量不含蟲株的稀釋液。

接種后每天觀察雞的精神狀況、糞便的質(zhì)地和顏色以及發(fā)病死亡情況。收集接種后5～7 d雞糞便中的卵囊，通過計(jì)算排卵囊總量和單卵囊繁殖力來比較雞E.maxima親本株和早熟株的繁殖力。其中，排卵囊總量為排卵囊期間每羽雞平均卵囊總產(chǎn)量。單卵囊繁殖力為每羽雞排卵囊總量與接種劑量的比值。

于接種后168 h，將雞逐一空腹稱體質(zhì)量后進(jìn)行剖解，記錄死亡數(shù)、體質(zhì)量、病變記分。通過死亡率、相對(duì)體質(zhì)量增加率并結(jié)合腸道病變記分對(duì)雞E.maxima早熟株和親本株的致病性進(jìn)行比較分析。其中，死亡率為各組死亡雞的數(shù)量與組內(nèi)雞總數(shù)的百分比。相對(duì)體質(zhì)量增加率=感染組雞平均增質(zhì)量/空白組雞平均增質(zhì)量×100%。病變記分依據(jù)JOHNSON等[9]的方法對(duì)雞小腸中段進(jìn)行病變記分。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Prism 6.0整理數(shù)據(jù)并繪制圖表，采用SPSS 17.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞E.maxima早熟株的選育

14日齡雛雞口服接種E.maxima親本株孢子化卵囊1.0×104個(gè)/羽來進(jìn)行早熟株的選育，結(jié)果顯示，每次傳代后其潛隱期可縮短1～2 h，在第13代時(shí)成功選育出潛隱期為113 h的E.maxima早熟株。繼續(xù)將選育出的E.maxima早熟株在雛雞體內(nèi)進(jìn)行連續(xù)擴(kuò)繁時(shí)發(fā)現(xiàn)，潛隱期能夠穩(wěn)定在113 h，且選育出的E.maxima早熟株繁殖力和致病性穩(wěn)定，能夠穩(wěn)定傳代，表明成功選育出E.maxima早熟株。

2.2 雞E.maxima早熟株和親本株潛隱期的卵囊形態(tài)

自雛雞接種E.maxima早熟株后每隔24 h隨機(jī)剖解3羽，觀察空腸中段腸黏膜中裂殖體、卵囊的數(shù)量及大小。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其第1代、第2代裂殖體數(shù)量與親本株接近，但是第3代裂殖體數(shù)量較親本株明顯減少；E.maxima早熟株接種后113 h，空腸腸道黏膜上皮中可見卵囊，形狀呈卵圓形，囊壁分2層，少數(shù)因附著顆粒狀物顯粗糙(圖1)，而親本株在124 h時(shí)方可見卵囊；且早熟株卵囊長(zhǎng)、寬平均為29.18 μm和21.74 μm，顯著小于親本株卵囊30.23 μm和22.13 μm(表1)。表明早熟株的發(fā)育與親本株相比存在缺陷。

圖1 接種E.maxima早熟株113 h后雞空腸黏膜中的E.maxima卵囊(400×)Fig.1 E.maxima oocysts in the jejunal mucosa of chicks after inoculation of E.maxima precocious strains 113 h(400×)

μm

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note:The different lowercase letters after data in the same column mean significant difference atP<0.05.

2.3 雞E.maxima親本株和早熟株的致病性分析

接種E.maxima親本株和早熟株孢子化卵囊的雞在接種后7 d內(nèi)均無死亡現(xiàn)象；臨床癥狀表現(xiàn)為精神不振、食欲下降、低頭縮頸；隨著E.maxima親本株和早熟株孢子化卵囊接種劑量的增加，雞的糞便變稀，內(nèi)容物呈橘黃色。由圖2和圖3可知，E.maxima親本株和早熟株接種雞的相對(duì)體質(zhì)量增加率均隨接種劑量的增加逐漸降低，而病變記分逐漸升高；當(dāng)雞E.maxima親本株和早熟株孢子化卵囊接種劑量為0.5×104～20.0×104個(gè)/羽時(shí)，早熟株組雞的相對(duì)體質(zhì)量增加率顯著大于親本株組；當(dāng)雞E.maxima親本株孢子化卵囊的接種劑量在10.0×104～20.0×104個(gè)/羽時(shí),親本株組雞的相對(duì)體質(zhì)量增加率無顯著性差異；接種劑量在10.0×104～20.0×104個(gè)/羽時(shí)，早熟株組雞的腸道病變記分顯著低于親本株組。表明隨接種劑量的增加，E.maxima親本株和早熟株對(duì)雛雞體質(zhì)量增加影響逐漸嚴(yán)重；且在相同接種劑量下，親本株的致病力強(qiáng)于早熟株。

2.4 雞E.maxima親本株和早熟株的繁殖力分析

當(dāng)雞E.maxima親本株和早熟株的接種劑量為0.1×104～20.0×104個(gè)/羽時(shí)，相同接種劑量下早熟株組的雞E.maxima卵囊產(chǎn)量均顯著低于親本株組，早熟株組雞的E.maxima卵囊產(chǎn)量是親本株組的60%～75%，表明在同等接種劑量下，早熟株卵囊繁殖力低于其親本株，且雞E.maxima親本株和早熟株的卵囊產(chǎn)量均隨接種劑量增加而增高(圖4)，但單卵囊繁殖力反而逐漸降低(圖5)。

*表示處理間差異顯著(P<0.05)，圖3和圖4同*means significant differences (P<0.05).The same as Fig.3 and Fig.4圖2 雞E.maxima親本株和早熟株不同接種劑量對(duì)雛雞體質(zhì)量的影響Fig.2 Effect of different inoculation dose of E.maximavirulent and precocious strains on the weight gain of chicks

圖3 雞E.maxima親本株和早熟株不同接種劑量對(duì)雛雞腸道的影響Fig.3 Effect of different inoculation dose of E.maximavirulent and precocious strains on the intestinal tract of chicks

圖4 雞E.maxima親本株和早熟株不同接種劑量對(duì)卵囊產(chǎn)量的影響

圖5 雞E.maxima親本株和早熟株不同接種劑量對(duì)E.maxima單卵囊繁殖力的影響

3 結(jié)論與討論

雞E.maxima親本株裂殖生殖階段發(fā)育完整，但由于早熟株最后1代裂殖體發(fā)育有缺陷，會(huì)導(dǎo)致卵囊形成并排出的時(shí)間較親本株縮短。因此，早熟選育法利用雞E.maxima親本株和早熟株排卵時(shí)間有差異的特點(diǎn)，通過親代蟲株多次選擇最早成熟的卵囊反復(fù)傳代，篩選出在生物學(xué)特性方面與親本株有差異的早熟株[10]。本研究中，雞E.maxima親本株的潛隱期為124 h，在經(jīng)過13代選育之后，早熟株的潛隱期與排卵高峰都提前11 h左右,早熟株的第1代、第2代裂殖體數(shù)量與親本株相近，而第3代裂殖體數(shù)量明顯減少,且早熟株卵囊顯著小于親本株，與蔣金書[11]關(guān)于球蟲早熟株特性的報(bào)道一致。

目前，已證實(shí)E.maxima的主要毒力來源于其裂殖生殖和配子生殖階段。由于E.maxima的裂殖體寄生在腸道絨毛較深的部位，且相對(duì)于其他球蟲來說體積較大，因此，在這個(gè)階段的E.maxima容易造成腸道上皮細(xì)胞的死亡，進(jìn)而使腸道上皮發(fā)生脫落崩解引起繼發(fā)性腸炎。本研究中，各試驗(yàn)組雞均無死亡且無異常表現(xiàn)，在雞E.maxima親本株和早熟株孢子化卵囊接種劑量為0.5×104～20.0×104個(gè)/羽時(shí)，同等劑量下親本株組雞的相對(duì)體質(zhì)量增加率均顯著低于早熟株組，且病變記分高于早熟株組。早熟株組雞小腸內(nèi)出現(xiàn)脹氣，漿膜發(fā)紅充血，腸內(nèi)容物少，各組病變記分均≤0.7；而親本株組雞的空腸可見少量出血點(diǎn)，內(nèi)容物呈黃褐色，各組病變記分均≤1.0。說明雞E.maxima親本株對(duì)雞腸道的致病作用強(qiáng)于早熟株。而E.maxima早熟株最后一代裂殖體發(fā)育不完全，形成的后代卵囊數(shù)量少，因而較其親本株對(duì)雞腸道造成的損傷更低，使其致病力減弱[12]。

本研究發(fā)現(xiàn)，在相同接種劑量下，雞E.maxima早熟株組卵囊產(chǎn)量均低于親本株組。劉麗丹[13]報(bào)道，在相同接種劑量下布氏艾美耳球蟲的繁殖能力顯著高于其選育的早熟株，與本研究結(jié)果相同。同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)，雞E.maxima親本株和早熟株孢子化卵囊接種劑量在20.0×104個(gè)/羽和10.0×104個(gè)/羽時(shí)，其卵囊產(chǎn)量并無顯著性差異，而且單卵囊繁殖力隨接種劑量的增高也逐漸降低，符合研究者提出的“擁擠效應(yīng)”[14]。當(dāng)接種量較低時(shí)，可供配子體寄生的腸黏膜上皮細(xì)胞數(shù)量多，充足的空間與營(yíng)養(yǎng)給與球蟲良好的生存條件，經(jīng)過有性生殖后生成的卵囊數(shù)量多且隨糞便排出體外，但是當(dāng)接種劑量較大時(shí)，腸道內(nèi)充滿被釋放的裂殖子，反而因?yàn)闆]有足夠的腸上皮細(xì)胞供其寄生而導(dǎo)致死亡并排出體外，達(dá)到“過飽和”狀態(tài)[15]。在本研究進(jìn)行致病性觀察時(shí)也發(fā)現(xiàn)了這一現(xiàn)象，即雞E.maxima親本株孢子化卵囊接種劑量在10.0×104個(gè)/羽和20.0×104個(gè)/羽時(shí)雞的相對(duì)體質(zhì)量增加率無顯著性差異，表明當(dāng)雞E.maxima親本株孢子化卵囊接種劑量在1.0×104～10.0×104個(gè)/羽時(shí)，雞的腸上皮細(xì)胞已達(dá)到感染數(shù)量閾值，早熟株組結(jié)果與之類似。

試驗(yàn)中對(duì)雞E.maxima親本株和早熟株的生物學(xué)特性進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，與親本株相比，早熟株對(duì)雞腸道的損傷程度降低、繁殖能力下降。本研究前期試驗(yàn)中，趙雁萍[16]也已經(jīng)對(duì)雞E.maxima山西株繁殖力作過相關(guān)研究，觀察到隨接種劑量的增加卵囊產(chǎn)量也隨之增大。本研究中也證實(shí)，雞E.maxima早熟株對(duì)雞的腸道損傷和增質(zhì)量影響沒有親本株嚴(yán)重，且早熟株在低劑量接種時(shí)對(duì)雞腸道的損失甚微。但是雞E.maxima早熟株是否保持其親本株完整的免疫原性，能否作為疫苗進(jìn)行球蟲病免疫，劑量該如何選擇還有待深入探究。