郭婷，林淑鳳，馬良，譚紅霞，張宇昊

(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715)

目前，乳及乳制品受到黃曲霉毒素M1(aflatoxin M1, AFM1)污染的現(xiàn)象越來越嚴(yán)重。2011年國家質(zhì)檢總局抽檢某批次純牛奶AFM1超標(biāo)140%；2012年廣州工商局抽檢發(fā)現(xiàn)部分幼兒奶粉AFM1含量超標(biāo)；2014年國家食藥監(jiān)總局公布抽檢的部分奶粉樣品AFM1超標(biāo)。AFM1是哺乳類動物攝入被黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1, AF B1)污染的飼料后，在體內(nèi)的肝微粒體單氧化酶系催化下，通過細(xì)胞色素P-448調(diào)節(jié)作用，其末端呋喃環(huán)C-10被羥化而生成AFM1存在于動物分泌的乳汁和尿液中，以乳中最為常見[1]。AFM1被世界衛(wèi)生組織列為I類致癌物，具有強(qiáng)致癌性和致突變性。中國、美國等國家規(guī)定乳及乳制品中AFM1最大限量為0.5 μg/kg[2]，歐盟規(guī)定生乳中AFM1的最大限量為0.05 μg/kg，嬰兒配方乳粉中為0.025 μg/kg[3]。

目前AFM1檢測方法主要有高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)[4-9]、免疫親和層析法(immunoaffinity chromatography，IAC)[10-12]、酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immune sorbent assay，ELISA)[13-14]等。其中色譜檢測方法靈敏，穩(wěn)定性強(qiáng)，但樣品前處理復(fù)雜，成本高，不能滿足目前食品安全快速檢測的要求。ELISA法操作簡便、用時短，但抗體的制備周期較長且穩(wěn)定性差。與其相比，適配體可體外合成，穩(wěn)定性好，在食品安全檢測領(lǐng)域顯示了巨大的應(yīng)用前景。

近年來，越來越多的科研工作者構(gòu)建基于適配體的傳感器[15-18]。YANG等[19]使用未修飾的金納米粒子(AuNPs)作為指示劑,實現(xiàn)對赭曲霉毒素(ochratoxin,OTA)的快速檢測。當(dāng)工作液中沒有OTA時，適配體吸附在AuNPs表面，在鹽溶液中保護(hù)AuNPs，未發(fā)生聚集現(xiàn)象，溶液為紅色。當(dāng)加入OTA后，適配體與OTA結(jié)合從而構(gòu)象變化形成G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)，而AuNPs在在鹽誘導(dǎo)下發(fā)生聚集導(dǎo)致顏色變化。BONEL等[20]開發(fā)了一種競爭性電化學(xué)傳感器用來檢測OTA。對辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)的活性反應(yīng)進(jìn)行檢測，根據(jù)活性變化檢測OTA。GUO等[21]利用PCR技術(shù)結(jié)合適配體實現(xiàn)了AFB1的痕量檢測，檢測限為25 fg/mL。

熒光傳感器因其簡便、高靈敏、快速等優(yōu)點而被廣泛的應(yīng)用于檢測領(lǐng)域[22-26]。隨著納米技術(shù)的快速發(fā)展，越來越多的納米材料(石墨烯、碳納米管、二硫化物等[27-32])應(yīng)用在熒光傳感器方面。GUO等[33]開發(fā)一種基于單壁碳納米管(single-walled carbon nanotubes, SWNTs)的熒光傳感器用于檢測OTA。利用熒光染料修飾適配體，SWNTs對染料具有很強(qiáng)的猝滅效果；但當(dāng)加入OTA時，其與適配體結(jié)合，使得適配體從SWNTs表面釋放下來，熒光恢復(fù)。LV等[34]在以上實驗基礎(chǔ)上利用DNA酶進(jìn)行信號放大，進(jìn)一步提高了檢測的靈敏度。然而，在實際熒光檢測過程中，工作液中混合納米材料及目標(biāo)物等多種物質(zhì)，納米材料的存在增加本底值的干擾，影響檢測靈敏度。

磁性納米材料因其較大的比表面積、磁性分離效果等特性，受到越來越多的科研工作者關(guān)注[35-37]。目前，使用Fe3O4磁性納米顆粒作為熒光猝滅劑的傳感平臺研究報道較少。本研究以AFM1為目標(biāo)物，F(xiàn)AM修飾的適配體為識別元件，利用磁性納米材料的猝滅性及磁分離性能，構(gòu)建基于適配體和磁性納米材料的熒光傳感器。檢測機(jī)理如圖1所示，F(xiàn)AM-適配體吸附在Fe3O4表面發(fā)生能量共振轉(zhuǎn)移，造成FAM-適配體的熒光猝滅；當(dāng)體系中加入AFM1時，F(xiàn)AM-適配體與AFM1結(jié)合，F(xiàn)AM-適配體從Fe3O4表面脫附，熒光恢復(fù)。

圖1 傳感器的傳感機(jī)理Fig.1 Illustration of sensor

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

紫外分光光度計(UV-2450),日本島津公司；熒光分光光度計(F-2500),日本日立公司；臺式高速離心機(jī),德國Eppendorf公司； 透射電子顯微鏡(JEM-1200EX),日本電子株式會社。

FAM-適配體(5′-ACT GCT AGA GAT TTT CCA CAT-3′)，生工生物工程(上海)有限公司；Tris,賽國生物科技有限責(zé)任公司；HCl,重慶川東化工有限公司；FeCl3·6H2O，氨水、甲醇、NaCl、乙腈、二氯甲烷,成都市科龍化工有限公司； FeCl2·4H2O,天津市大茂化學(xué)試劑廠； AFM1、AFB1、展青霉毒素(PAT)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)、單端孢霉烯(T-2)毒素標(biāo)準(zhǔn)品,美國Sigma公司；純牛奶,購于本地超市，250 mL；營養(yǎng)奶粉,購于本地超市，400 g；脫脂牛奶,購于本地超市，1 L。

1.2 試驗方法

1.2.1 Fe3O4磁性納米顆粒的合成

采用液相共沉淀法制備Fe3O4磁性納米顆粒，將12.16 g FeCl3·6H2O與4.97 g FeCl2·4H2O溶解于200 mL蒸餾水中，劇烈攪拌并緩慢加入氨水，調(diào)節(jié)pH至9.0左右，于80 ℃熟化30 min得到Fe3O4粒子黑色溶液，用永磁體收集并用超純水和乙醇交替洗滌后冷凍干燥，得到干燥黑色固體粉末。

1.2.2 DNA濃度測定

DNA濃度以單鏈濃度表示，利用紫外-可見分光光度計測定DNA在260 nm處的吸光度，依據(jù)朗伯比爾定律(A=εbc)計算得DNA的濃度，配置成100 nmol/L(Tris-HCl pH 8.0)的溶液，于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 熒光傳感器對AFM1的檢測

DNA備用溶液解凍后，水浴90 ℃處理10 min，逐漸冷卻至室溫備用。將Fe3O4溶液加入工作液(100 nmol/L DNA溶液)中，再將一定濃度的FAM1加入工作液中作用20 min，利用磁鐵分離。取清液測定熒光光譜(激發(fā)波長480 nm)。

1.2.4 實際樣品中AFM1的檢測

向樣品中加入一定量的AFM1，分別配成質(zhì)量濃度為0.25、0.50、0.75 μg/L的陽性樣本。(1)液體樣品：取5 mL液態(tài)樣品(純牛奶和脫脂牛奶)置于離心管中，加入10 mL甲醇和0.5 g NaCl后旋渦振蕩混勻30 s，在37℃下超聲5 min，離心后取上清液過0.22 μm有機(jī)微孔濾膜得一定體積微萃取工作液；(2)固體樣品：稱取1 g固體樣品(奶粉)置于離心管中，加入5 mL水，旋渦混勻后，加入10 mL甲醇和0.5 g NaCl并旋渦振蕩混勻30 s，在37 ℃下超聲5 min，離心后取上清液過0.22 μm有機(jī)微孔濾膜得一定體積微萃取工作液。將1 mL微萃取工作液、200 μL分散劑乙腈和60 μL萃取劑二氯甲烷加入離心管中，旋渦混勻成均勻的乳濁液，靜置1 min，離心后抽取下層有機(jī)相CH2Cl230 μL于試管中，37 ℃水浴氮吹。將干燥物溶解于Tris-HCl緩沖液中制成樣品溶液。然后按照構(gòu)建的熒光傳感器檢測。另外，根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)采用液相色譜法進(jìn)行方法對照實驗。

2 結(jié)果與討論

2.1 Fe3O4磁性納米顆粒的制備及表征

采用液相共沉淀法制Fe3O4磁性納米顆粒的反應(yīng)原理如下：

Fe2++2Fe3++8OH-=Fe3O4+4H2O

Fe2+與Fe3+在堿性條件下高溫處理，合成黑色Fe3O4磁性納米顆粒。利用透射電子顯微鏡對其進(jìn)行表征，具體表征結(jié)果如圖2-A所示。結(jié)果顯示該方法制備的Fe3O4粒徑約為8～15 nm。圖2-B顯示Fe3O4的磁滯回歸線，說明該Fe3O4具有良好的磁分離能力，能夠快速完成分離效果。

圖2 Fe3O4磁性納米顆粒的透射電鏡圖(A)和磁滯回歸線(B)Fig.2 TEM images(A) and magnetization curves of Fe3O4(B)

2.2 檢測原理

本研究以AFM1為研究對象，構(gòu)建熒光傳感器。將染料FAM修飾在適配體的一端，其熒光光譜圖如圖3曲線a。加入Fe3O4溶液后，F(xiàn)AM-適配體通過靜電相互作用吸附在Fe3O4表面，F(xiàn)e3O4與FAM-適配體發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，熒光信號猝滅，如圖3曲線d所示；當(dāng)體系中加入AFM1時，F(xiàn)AM-適配體與AFM1識別并形成一定結(jié)構(gòu)，致使FAM-適配體從Fe3O4表面脫附，熒光信號恢復(fù)，如圖3中曲線c所示。

a-FAM-適配體;b-FAM-適配體+AFM1;c-FAM-適配體+Fe3O4+AFM1;d-FAM-適配體+Fe3O4;e-AFM1圖3 不同條件下熒光光譜Fig.3 Fluorescence spectra under different conditions

因此，可以通過檢測熒光信號強(qiáng)弱與體系中AFM1的濃度的關(guān)系，實現(xiàn)AFM1的定量檢測。

2.3 檢測條件優(yōu)化

2.3.1 Fe3O4濃度

Fe3O4與FAM-適配體濃度比例在很大程度上影響會影響熒光傳感器的靈敏度，因此考察二者的濃度比顯得十分重要。如圖4所示，含有100 nmol/L的FAM-適配體的緩沖溶液中，熒光強(qiáng)度隨Fe3O4濃度的增加而急劇降低，當(dāng)Fe3O4質(zhì)量濃度到達(dá)0.35 mg/mL時，熒光強(qiáng)度趨于穩(wěn)定，當(dāng)Fe3O4質(zhì)量濃度繼續(xù)增加時，對FAM-適配體熒光的猝滅效果沒有顯著影響，且過量的Fe3O4會降低傳感器的靈敏度。因此，選用0.35 mg/mL作為在后續(xù)實驗中Fe3O4濃度。

不同質(zhì)量濃度Fe3O4下FAM-適配體的熒光光譜(a-0.1、b-0.2、c-0.3、d-0.35、e-0.4、f-0.45、g-0.5、h-0.6、i-0.8 mg/mL)圖4 不同質(zhì)量濃度Fe3O4對體系熒光強(qiáng)度的影響Fig.4 Effect of different concentrations of Fe3O4 on the fluorescence

2.3.2 熒光恢復(fù)時間

實驗中添加AFM1后需要孵育一段時間才能引起熒光信號恢復(fù)，本實驗研究了孵育時間0～80 min的熒光恢復(fù)情況。如圖5所示，隨著FAM-適配體和AFM1孵育時間的延長，熒光強(qiáng)度逐漸增加，20 min后趨于穩(wěn)定。因此本研究選擇20 min最佳熒光恢復(fù)時間。

插圖：不同孵育時間對應(yīng)的FAM-適配體(100 nmol/L)的熒光光譜(a-80、b-60、c-50、d-40、e-30、f-20、g-15、h-10、i-5、j-0 min)圖5 不同孵育時間對熒光恢復(fù)的影響Fig.5 Effect of incubation time on fluorescence intensity

2.4 熒光傳感器的構(gòu)建

在上述優(yōu)化實驗條件下，以AFM1為目標(biāo)構(gòu)建熒光傳感器。在熒光傳感器中，加入不同濃度AFM1溶液。研究發(fā)現(xiàn)，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著AFM1質(zhì)量濃度的增大，AFM1與更多的FAM-適配體結(jié)合，脫離Fe3O4，熒光強(qiáng)度逐漸恢復(fù)，如圖6所示。然而，當(dāng)AFM1的質(zhì)量濃度達(dá)到一定值時，熒光強(qiáng)度不再明顯增加，達(dá)到平衡。熒光強(qiáng)度與AFM1質(zhì)量濃度范圍在0.05～0.70 μg/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，檢出限為0.02 μg/L。

AFM1質(zhì)量濃度a-0.05、b-0.1、c-0.2、d-0.3、e-0.4、f-0.5、g-0.6、h-0.7、i-0.8、j-0.9、k-1.0 μg/L圖6 不同濃度AFM1對所構(gòu)建傳感器熒光響應(yīng)變化(A)和熒光與AFM1濃度的線性關(guān)系(B)Fig.6 Fluorescence spectrum of sensor with different concentrations of AFM1(A) and relationship between F and concentrations of AFM1(B)

2.5 熒光傳感器選擇性

為了研究熒光傳感器的選擇性，本研究以AFB1、OTA、DON、PAT、T-2為對象考察該傳感器的特異性。結(jié)果如圖7所示，當(dāng)加入0.5 μg/L AFM1時，熒光強(qiáng)度顯著增加。加入10 μg/L對照毒素時熒光強(qiáng)度沒有出現(xiàn)明顯增強(qiáng)。結(jié)果表明本研究所構(gòu)建的傳感器對AFM1有較好的特異性。

圖7 方法選擇性Fig.7 Selectively of sensing systemAFM1質(zhì)量濃度為0.5 μg/L，其他對照毒素質(zhì)量濃度均為10 μg/L

2.6 實際樣品測定

為了考察傳感器實際測定效果，我們以純牛奶、脫脂牛奶和奶粉作為實際陰性樣品，研究加標(biāo)回收情況，并用液相色譜法進(jìn)行對照實驗。結(jié)果如表1所示，利用傳感器檢測的加標(biāo)回收率在82.5%～102.3%的范圍內(nèi)，這說明該熒光傳感器可用于真實復(fù)雜樣品中AFM1的測定。

3 結(jié)論

本研究構(gòu)建一種基于適配體和磁性納米材料的熒光傳感器，可用于高靈敏度、高特異性檢測AFM1。在最優(yōu)條件下，傳感器的線性范圍0.05～0.70 μg/L，檢測限為0.02 μg/L。且在實際樣品檢測中同樣表現(xiàn)出較好的效果，說明本檢測方法在食品安全檢測中具有較強(qiáng)的實用性。為開發(fā)快速、靈敏和高選擇性的食品安全生物傳感器開辟了新的途徑。

表1 實際樣品加標(biāo)回收率(n=3)Table 1 Real sample spike recovery (n=3)