王晨慧，李春揚,2，張曉磊,2*，饒靜,2，辛鵬,2，尹建軍,2，宋全厚,2

1(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京，100015) 2(國家食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，北京，100015)

山藥酒是以山藥為主要原料，經(jīng)糖化、發(fā)酵、浸泡等工藝釀制而成的飲料酒，因具有滋養(yǎng)強壯，助消化，斂虛汗，止瀉之保健功效，日漸成為消費者喜愛的酒種[1]。萜類化合物是天然產(chǎn)物中的一類重要的次生代謝產(chǎn)物，由甲戊二羥酸衍生而成，結構復雜多變，分子式為異戊二烯單位倍數(shù)((C5H8)n)的烴類及其含氧衍生物，依據(jù)分子結構中異戊二烯單元的數(shù)目不同分為不同類型，如：(C5H8)1為半萜類，(C5H8)2為單萜類，(C5H8)3為倍半萜類等，它們多以游離態(tài)存在，部分以糖、酯或內(nèi)酯形式存在于生物體中，具有抗腫瘤、消炎、降血脂等功效，萜類化合物也是山藥中的生物活性成分，經(jīng)發(fā)酵而成的山藥酒，可最大程度的保留其功效[2]。目前，國內(nèi)外對萜烯類化合物的研究主要集中于白酒[3-4]、葡萄酒[5-6]、蘋果酒[7]中，采用固相萃取(SPE)、固相微萃取(SPME)等前處理技術與氣相色譜質(zhì)譜(GC-MS)或氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS-MS)相結合，可實現(xiàn)對萜烯類化合物的分析定量。

山藥酒作為我國特有的新興酒種，其萜烯類化合物的測定技術尚屬空白。本研究以不同工藝制備的山藥酒種為分析對象，針對其基質(zhì)復雜及風味物質(zhì)干擾等難題，優(yōu)化建立了山藥酒中萜烯類化合物的分析技術，并采用這一技術探索不同山藥酒中萜烯類化合物組成特征，為深入研究山藥酒的保健功效，提升產(chǎn)品品質(zhì)，提供技術手段和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山藥原酒(1)，山藥露酒(2～7),山藥黃酒(8～9)：河南焦作。

葉綠醇(純度≥98%)：南京羅奇特生物科技有限公司;香茅醇(純度≥95%)、ɑ-松油醇(純度≥97%)、芳樟醇(純度≥98%)：百靈威科技有限公司;長葉松烯(純度≥83.1%)、(-)-龍腦(純度≥98%)、橙花叔醇(純度≥98.5%)、合金歡醇(純度≥97%)、2,4-癸二烯醛(純度≥90%)、角鯊烯(純度≥98%)、p-傘花烴(純度≥98%，內(nèi)標)、甲醇(色譜純)、正戊烷(色譜純)、乙醚(分析純，純度≥98%)：上海安譜實驗科技股份有限公司;NaCl、二氯甲烷、無水硫酸鈉：分析純，北京化工試劑廠。

1.2 儀器與設備

島津GC/MS-QP2010 Plus氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(配備AOC5000自動進樣器),日本島津公司;Milli-Q Reference超純水系統(tǒng),美國Millipore公司;85 μm PA聚丙烯酸酯微萃取頭,美國Supelco公司;INNOWAX色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 mm),美國HEWLETT PACKARD公司。

1.3 方法

1.3.1 頂空固相微萃取(HS-SPME)條件[8]

稱取4 g NaCl于事先放置玻璃轉子的頂空瓶中，加入10 mL已稀釋至10%(體積分數(shù))的酒樣，將固相微萃取萃取頭插入已平衡15 min的頂空瓶，在40 ℃磁力攪拌水浴鍋內(nèi)保溫萃取45 min，隨后將萃取頭取出，直接供GC/MS分析。

1.3.2 同時蒸餾萃取(SDE)條件[9]

量取50 mL酒樣于SDE裝置右側圓底燒瓶中，加250 mL蒸餾水，左側接入裝有50 mL二氯甲烷的圓底燒瓶，保持兩側微沸萃取8 h，冷卻并收集有機相過無水硫酸鈉脫水，氮吹至1 mL供GC-MS分析。

1.3.3 液液萃取(LLE)條件[4]

量取50 mL酒樣并將酒精度稀釋至10%，加NaCl至飽和，再用50mL、50 mL、30 mL正戊烷∶乙醚[V(正戊烷)∶V(乙醚)=1∶1]萃取3次，萃取液中加入50 mL超純水，用Na2CO3-NaHCO3緩沖溶液調(diào)節(jié)水相pH為10，有機相過無水硫酸鈉后氮吹濃縮至5 mL。

依次用50 mL甲醇、50 mL乙醚和50 mL正戊烷預淋洗硅膠柱(20 cm×2 cm)。將濃縮后的有機相加入硅膠柱中，以流速1 mL/min依次用50 mL重蒸戊烷(F1)，50 mL重蒸的戊烷∶乙醚(體積比分別為80∶20，F(xiàn)2；50∶50，F(xiàn)3)， 50 mL甲醇(F4)洗脫得到4個組分(控制洗脫流速在1～1.5 mL/min)。收集各組分，氮吹濃縮至200 μL，待GC-MS分析。

1.3.4 GC-MS條件

色譜條件：所用色譜柱為HP-INNOWAX(30 m×0.25 mm，0.25 mm)，柱溫采用程序升溫，初溫35 ℃，保持2 min后以2 ℃/min升至90 ℃，再以5 ℃/min升至200 ℃，保持10 min后以6 ℃/min升至230 ℃，保持10 min。進樣口溫度250 ℃，不分流進樣1 min，載氣為氦氣。

質(zhì)譜條件：MS電離方式為EI，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，質(zhì)譜掃描范圍35～350 amu，質(zhì)譜分析所用數(shù)據(jù)庫為NIST14庫。

1.3.5 標準溶液的配制

稱取萜烯類標準品10 mg(精確至0.01 mg)至10 mL容量瓶中，以正戊烷溶解并定容，配制成質(zhì)量濃度為1. 0 mg/mL的萜烯類化合物標準儲備液，再逐級稀釋至一系列質(zhì)量濃度梯度的混合標準溶液，每一質(zhì)量濃度梯度的混合標準溶液中加入5 μL終質(zhì)量濃度為0.533 mg/L的p-傘花烴為內(nèi)標。

2 結果與分析

2.1 分析方法的選擇和優(yōu)化

萜類化合物在植物中一般以結合態(tài)和游離態(tài)存在，部分游離態(tài)化合物含量較低，加之山藥酒酒精度較高，醇酯類揮發(fā)性化合物種類多，因此必須選擇適當?shù)臉悠非疤幚矸椒ńY合靈敏度較高的儀器分析技術，才能實現(xiàn)準確分析的目標[10]。本實驗選擇HS-SPME、SDE、LLE三種前處理方法進行優(yōu)選，這也是酒中揮發(fā)性成分測定較多采用的3種經(jīng)典方式，并結合GC-MS條件的優(yōu)化，建立山藥酒中痕量萜類化合物的的分析技術。

分別對3種方法提取的樣品液進行GC-MS分析，根據(jù)可定性組分數(shù)量進行比較。圖1為頂空固相微萃取(a)、同時蒸餾萃取(b)、液液萃取F1組分(c)及F3組分(d)的總離子流圖，采用HS-SPME、SDE、LLE 3種方式分別鑒定出4種、7種和10種萜烯類化合物，采用LLE具有較好的效果。

圖1 不同方法比較GC-MS總離子流圖Fig.1 Comparison of GC-MS total ion chromatograms by different methods

其中，采用HS-SPME萃取方式，酒中大量酯類和醇類等含量較高的組分極易被吸附，導致痕量萜類組分被包在這些組分內(nèi)，響應值低，較難定性；同時蒸餾萃取法是通過同時加熱樣品液與有機溶劑至沸騰來實現(xiàn)目標成分的富集、濃縮，由于制備過程中長時間加熱，造成小分子萜烯的揮發(fā)和氧化，減少了這些成分的檢出率；而LLE方式，萜類化合物在飽和食鹽水中溶解度較低，易被有機試劑萃取，利用正相色譜技術將萃取液按極性大小洗脫，分段收集，從而減少損失，最大限度提取目標化合物，因此本實驗采用這一方式對山藥酒中萜類痕量成分進行提取。

參照FAN等[11]的實驗方法，對提取溶劑種類、洗脫液配比進行選擇和優(yōu)化，并根據(jù)組分分離效果對程序升溫條件進行優(yōu)化，結果表明通過V(正戊烷)∶V(乙醚)=1∶1萃取后,經(jīng)溶劑洗脫實現(xiàn)了山藥酒中10種萜類化合物的準確定性定量，萜類化合物主要集中在F1(反式橙花叔醇、長葉松烯、芳樟醇、香茅醇)、F3組分(角鯊烯、(-)-龍腦、植醇、合金歡醇)中，F(xiàn)2(反式，反式-2,4-癸二烯醛)和F4組分(α-松油醇)各檢測到1種萜類成分。

2.2 山藥酒中萜烯類化合物定量方法評估

通過線性范圍及相關系數(shù)、檢出限和定量限以及相對標準偏差和回收率，對方法進行綜合評估，結果見表1。

表1 10種萜類化合物的方法學評估結果Table1 Methodological evaluation results of 10 terpenoids

注：f表示作標準曲線所取的點數(shù)。

其中，各萜烯類化合物標準曲線線性范圍在11.9～30 390.2 μg/L，相關系數(shù)R2均大于0.993 6，具有較好的線性；分別以信噪比為3和信噪比為10時的質(zhì)量濃度作為檢出限和定量限，其檢出限為0.56～26.96 μg/L，定量限為1.86～89.88 μg/L；分別采用該方法對樣品平行測定6次計算其相對標準偏差，在0.4%～1.7%之間；通過添加近等量的標準品，平行測定6次，加標回收率在92.68%～103.21%。上述結果顯示該方法靈敏度高，結果準確可靠，可滿足山藥酒中痕量萜烯類化合物定量分析要求。

2.3 山藥酒中萜烯類化合物組成及保健功效

分別對山藥原酒(1)、山藥露酒(2～7)、山藥黃酒(8～9)中萜烯類化合物進行分析，其化合物類別和含量詳見表2。

從萜烯類化合物組成看，3個類別山藥酒中共鑒定出10種萜烯類化合物，包括5種單萜類化合物，分別為芳樟醇、香茅醇、反式2,4-癸二烯醛、(-)-龍腦和α-松油醇、3種倍半萜烯類化合物為橙花叔醇、長葉烯與合金歡醇，1種二萜類化合物葉綠醇，1種三萜類化合物角鯊烯，其中山藥原酒和露酒均檢出10種萜烯類化合物，而山藥黃酒未檢出合金歡醇。這3類山藥酒其原料均產(chǎn)自河南焦作，盡管釀造工藝不同，但所含萜類化合物種類相近，表明其原料產(chǎn)地對山藥酒中萜烯類組成具有一定的影響。

從萜烯類化合物含量來看，各山藥酒均存在差異，萜烯類化合物總量最高的是山藥原酒，為293.24 μg/L，其中萜烯烴含量為36.168 μg/L，萜烯氧化物含量為257.072 μg/L；山藥露酒中萜烯類總量在42.266～183.253 μg/L，多為萜烯氧化物；山藥黃酒萜烯類化合物總量相近，但組成差異較大，其中8#樣品以萜烯烴類化合物為主，含量為112.75 μg/L，樣品9中則主要是萜烯類氧化物，達到總量的90.97%。結果表明，不同加工工藝對山藥酒中萜類化合物的含量產(chǎn)生一定影響。

表2 山藥酒中萜烯類化合物測定結果Table 2 Determination results of terpenes in yam wine

注：n.d.表示沒有檢測到；

從單個萜烯的含量來看，長葉松烯(平均含量7.968 μg/L)、角鯊烯(平均含量15.513 μg/L)、龍腦(平均含量33.341 μg/L)和香茅醇(平均含量36.408 μg/L)在不同工藝的山藥酒中含量均較高，特別是龍腦，在山藥原酒中其質(zhì)量濃度達到100.164 μg/L，占萜烯類總量的34.16%。除上述物質(zhì)，植醇和合金歡醇在山藥原酒中含量較高，質(zhì)量濃度分別為77.81 μg/L和29.74 μg/L；山藥露酒含有較為豐富的是葉綠醇(平均含量49.175 μg/L)，山藥黃酒中α-松油醇在萜類總量中也占有較大比例，達到8.3%。

山藥酒中這些萜烯類化合物不僅具有獨特的香味，還具有一定的保健功能，如龍腦具有類似樟腦和松木的氣息[12]。據(jù)藥典(2015)記載，龍腦常用量為0.3～0.9 g，主治開竅醒腦、清熱解毒等；吳娟等[13]通過大鼠尾靜脈注射15 μg/g即可促進血腦屏障通透性；長葉松烯，給人以精神振奮之感，并有抗菌、消毒的功效[14]；姜文廣等[15]闡述了芳樟醇是合成維生素E的重要中間體，具有鎮(zhèn)痛、抗焦慮、鎮(zhèn)靜催眠、抗炎、抗腫瘤、抗菌等藥理活性，其中BATISTA[16]采用口服方式給予小鼠芳樟醇(5～100 μg/g)可達到鎮(zhèn)痛作用；國外相關文獻發(fā)現(xiàn)橙花叔醇、角鯊烯具有抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等活性[17-20]。目前，萜類化合物多種功效的作用機制有待進一步明確，對這些功效成分的剖析，將有助于山藥酒這一新興酒種的深度開發(fā)與研究。

3 結論

本實驗針對山藥酒特點，通過實驗條件的選擇、優(yōu)化，建立了液液萃取結合氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術對山藥酒中萜烯類化合物的分析方法，實現(xiàn)對10種萜類化合物的準確定量，包含5種單萜類化合物，3種倍半萜烯類化合物，以及二萜類化合物及三萜類化合物各1種，對此方法進行評估，其相關系數(shù)R2≥0.993 6，檢出限為0.56～26.96 μg/L，定量限為1.86～89.88 μg/L，相對標準偏差小于1.7%，加標回收率為92.68%～103.21%，表明該方法靈敏度高，結果準確可靠，可滿足山藥酒中痕量萜烯類化合物定量分析要求。采用這一技術對市售山藥原酒、山藥露酒和山藥黃酒進行分析，其萜烯類化合物組成相近，但含量存在差異，表明原料產(chǎn)地與加工工藝對萜類化合物的構成具有一定的影響；從組成結構看，長葉松烯、角鯊烯、龍腦和香茅醇在不同山藥酒中含量均較高，這些萜烯類賦予了山藥酒獨特的風味及保健功效，對其進行深入研究，將有助于山藥酒的品質(zhì)提升與深度開發(fā)。