張翔，李星星，黃雪松

(暨南大學(xué) 食品科學(xué)與工程系，廣東 廣州，510632)

澳洲堅(jiān)果(MacadamiaternifoliaF. Muell.)別名：昆士蘭栗、澳洲胡桃、夏威夷果、昆士蘭果，原產(chǎn)于澳大利亞[1]，其果仁不僅口感酥脆、風(fēng)味獨(dú)特，而且營養(yǎng)豐富。其含油量80%，多糖含量6%，蛋白質(zhì)含量9%[2]。近年來，我國澳洲堅(jiān)果產(chǎn)業(yè)規(guī)模不斷擴(kuò)大，產(chǎn)業(yè)鏈繼續(xù)延伸，但其深加工產(chǎn)品甚少，部分堅(jiān)果用于榨油，但榨油后所產(chǎn)生約20%油粕仍未開發(fā)利用，造成了較大的資源浪費(fèi)。因此，亟需開發(fā)利用澳洲堅(jiān)果油粕的生產(chǎn)技術(shù)。

糖蛋白是一類由糖類與多肽或蛋白質(zhì)以共價(jià)鍵連接而成的結(jié)合蛋白，含有肽鏈、糖肽鍵和糖鏈等結(jié)構(gòu)[3]。隨著糖生物學(xué)的不斷發(fā)展，越來越多的研究表明糖蛋白復(fù)合物具有增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)[4]、抑制腫瘤[5]、降低血糖[6]、血酯[7]、抗氧化[8]、防衰老[9]等活性功效[10]，也有具有多種功能的糖蛋白，這些活性使其在保健食品及新藥開發(fā)方面具有極大應(yīng)用價(jià)值。目前國內(nèi)的文獻(xiàn)中，報(bào)道了不同澳洲堅(jiān)果不同種質(zhì)果仁粗脂肪及脂肪酸成分[11]和澳洲堅(jiān)果多肽的制備[12]，但未見有關(guān)澳洲堅(jiān)果糖蛋白及其生理活性的報(bào)道。本文擬以澳洲堅(jiān)果油粕為原料，分離、純化、鑒定澳洲堅(jiān)果中的糖蛋白，為進(jìn)一步開發(fā)利用澳洲堅(jiān)果提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

澳洲堅(jiān)果油粕，由廣西省岑溪市壽香鄉(xiāng)有機(jī)農(nóng)產(chǎn)品開發(fā)有限公司惠贈(zèng)；Sephadex G-100 凝膠，美國GE公司；DEAE-52纖維素，上海鼎國生物技術(shù)有限公司；NaOH、HCl、葡萄糖、苯酚、硫酸、三氟乙酸、氯仿、無水乙醇:分析純,天津市大茂化學(xué)試劑廠。

DF-101S集熱器恒溫加熱磁力攪拌器，河南碩杰儀器設(shè)備有限公司；PHS-3C雷磁pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；UV-9600紫外-可見分光光度計(jì)，北京瑞利分析儀器公司；SCIENTZ-10N冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；LC-20A高效液相色譜儀器，日本島津公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 提取方法

稱取200 g澳洲堅(jiān)果油粕，加入300 mL正己烷，置于磁力攪拌器攪拌6 h，過濾，待澳洲堅(jiān)果中的正己烷完全揮發(fā)后獲得約140 g完全無脂肪的澳洲堅(jiān)果仁脫脂粉。按照m(脫脂粉)∶m(水)=1∶12的比例加入水，經(jīng)熱水浸提；將熱水浸提后的殘?jiān)侔凑樟弦罕?∶12用1 mol/L Na2CO3調(diào)節(jié)提取液pH值為9.0，加熱至沸提取3 h。提取液經(jīng)抽濾后，于60 ℃減壓濃縮至一定體積，采用30%、60%、90%的乙醇溶液分級沉淀，得90%乙醇沉淀后用無水乙醇和丙酮洗滌沉淀，用雙蒸水溶解沉淀后凍干。

1.2.2 分離純化

使用14 kDa的透析袋，將粗提物透析48 h后，凍干后待用。

(1)DEAE-52陰離子交換柱分離純化

稱取100 mg澳洲堅(jiān)果粗提物，溶于20 mL雙蒸水中，用移液槍貼壁緩慢加樣至DEAE-52陰離子交換柱(2.5 cm×30 cm)，待其完全進(jìn)入層析柱后，用雙蒸水洗脫2 h，然后依次采用0.2、0.4、0.6 mol/L NaCl溶液洗脫，使用恒流泵控制洗脫流速為1 mL/min，每管收集10 mL，采用苯酚硫酸法跟蹤檢測各管中的多糖含量。同時(shí)以收集的管數(shù)為橫坐標(biāo)，于紫外490 nm測定的吸光值為縱坐標(biāo),繪制洗脫曲線。收集吸收峰樣品，透析凍干。

(2)Sephadex G-100分離純化

將(1)中收集的樣品配成質(zhì)量濃度為10 g/L，上樣于Sephadex G-100層析柱(1.2 cm×50 cm)，采用雙蒸水洗脫，使用恒流泵控制洗脫流速為0.5 mL/min，每管收集5 mL，按照(1)中所述的方法繪制洗脫曲線，收集吸收峰樣品凍干。

1.2.3 結(jié)構(gòu)分析

(1)HPLC鑒定純度和測定分子量

將色譜純葡萄糖、T-5、T-40、T-200、T-2000葡聚糖均用雙蒸水配5 g/L多糖分子量標(biāo)樣，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后進(jìn)樣。同時(shí)采用葡萄糖和T-2000葡聚糖標(biāo)定Vt和V0，由保留時(shí)間Ve計(jì)算得到相應(yīng)的分配系數(shù)Kav，計(jì)算公式如公式(1)所示：

(1)

以分子量的對數(shù)(lgMw)為橫坐標(biāo)，Kav為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=-0.207 5x+1.282 5，R2=0.985。同時(shí)將澳洲堅(jiān)果糖蛋白進(jìn)樣，根據(jù)保留時(shí)間計(jì)算相對分子質(zhì)量。

色譜條件：色譜柱為PolySep-GFC-P4000柱(7.8 mm×300 mm)，流動(dòng)相為純水，流速0.5 mL/min，柱溫30 ℃，檢測器為ELSD蒸發(fā)光散射檢測器。

(2)紫外-可見光光譜掃描

將澳洲堅(jiān)果糖蛋白配成質(zhì)量濃度為0.5 g/L，在波長200～800 nm處進(jìn)行掃描。

(3)多糖和蛋白含量的測定

蛋白含量測定采用2，2′-聯(lián)喹啉-4，4′-二羧酸法(BCA法)[13]，總糖含量測定采用苯酚硫酸法[14]。

(4)紅外光譜分析

稱取1 mg澳洲堅(jiān)果糖蛋白樣品，取適量KBr粉末與樣品在瑪瑙研缽中充分研磨均勻后，用壓片機(jī)壓成薄片，采用傅里葉變換光譜進(jìn)行掃描[15]，掃描次數(shù)為32次，掃描范圍4 000～400 cm-1。

(5)糖肽鍵的測定

通過β-消去反應(yīng)測定澳洲堅(jiān)果糖蛋白中的O-糖肽鍵[16]。稱取2 mg樣品溶解于0.2 mol/L NaOH溶液中，另取2 mg樣品溶解于蒸餾水中作為對照，在45 ℃水浴鍋中反應(yīng)60 min,于波長200～350 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描。

(6)單糖組成分析

①混合單糖標(biāo)準(zhǔn)品衍生化

采用PMP柱前衍生化高效液相色譜法測定澳洲堅(jiān)果糖蛋白的單糖組成[17]。分別配制質(zhì)量濃度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g/L的各單糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液以及各單糖的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，移取100 μL各單糖的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別加入100 μL 0.3 mol/L NaOH和100 μL 0.5 mol/L PMP-甲醇溶液，于70 ℃電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中反應(yīng)90 min，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，加入100 μL 0.3 mol/L HCl中和后再加入1 mL純水，然后加入2 mL氯仿漩渦萃取5 min，10 000 r/min離心10 min，棄去氯仿層，重復(fù)萃取3次，取水相經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后進(jìn)樣分析繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

色譜條件：色譜柱為Bio-Bond 5 μm C18(4.6 mm×250 mm)；流動(dòng)相為V[0.05 mol/L KH2PO4(pH=6.9)]∶V(乙腈)=78∶22，流速為0.6 mL/min，進(jìn)樣體積10 μL，柱溫30 ℃。

如圖1所示，7種標(biāo)準(zhǔn)單糖的峰型勻稱，混合單糖在高效液相色譜中能夠具有較好的分離效果。

1-甘露糖;2-葡萄糖醛酸;3-鼠李糖;4-半乳糖醛酸;5-核糖; 6-半乳糖;7-阿拉伯糖圖1 混合單糖標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖Fig.1 High-performance liquid chromatograms of mixed monosaccharide standards

②水解糖蛋白

采用三氟乙酸水解澳洲堅(jiān)果糖蛋白[18]。稱取澳洲堅(jiān)果糖蛋白5 mg，加入5 mL 4 mol/L三氟乙酸，110 ℃下水解6 h，減壓濃縮干燥后，加入甲醇洗滌3次，旋蒸除去溶劑后，加入1 mL純水溶解，得水解樣品溶液。取100 μL水解樣品溶液進(jìn)行柱前衍生化實(shí)驗(yàn)，測定單糖組成。

(7)體外抗氧化活性測定

通過測定總還原能力、清除DPPH自由基能力對提取純化的澳洲堅(jiān)果糖蛋白M-1的抗氧化能力進(jìn)行評定。采用DPPH法測定DPPH自由基清除率[19]，采用鐵氰化鉀法測定總還原力[20]。以上測定均采用維生素C(VC)作為對照，并按照公式(2)進(jìn)行計(jì)算：

(2)

公式中：Aj為對照品吸光度；Ai為樣品吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離純化結(jié)果

2.1.1 DEAE-52柱層析分離結(jié)果

如圖2所示，經(jīng)DEAE-52層析柱分離出2個(gè)部分，分別為0.2、0.4 mol/L NaCl溶液洗脫出的部分，按照圖2所示的出峰管號，因峰2樣品含量較少，故取峰1量大的部分用于進(jìn)一步研究。收集峰1吸收峰的各管溶液，60 ℃下減壓濃縮，雙蒸水透析48 h，凍干透析后的樣品得澳洲堅(jiān)果多糖組分，用于進(jìn)一步Sephadex G-100凝膠層析柱純化。

圖2 澳洲堅(jiān)果多糖DEAE-52洗脫曲線Fig.2 DEAE-52 elution curves of macadamia polysaccharide

2.1.2 Sephadex G-100凝膠柱層析結(jié)果

由圖3所示，DEAE峰1樣品經(jīng)葡聚糖凝膠G100層析柱分離，得到單一峰樣品，可見該峰純度比較高，可作為進(jìn)一步研究其理化性質(zhì)的純多糖。收集吸收峰樣品，凍干得澳洲堅(jiān)果多糖樣品，記為“M-1”。

圖3 峰1葡聚糖凝膠G100洗脫曲線Fig.3 Sephadex G100 elution curve of peak 1

2.2 M-1的鑒定與分析

2.2.1 M-1的鑒定和分子量測定

由圖4所示，經(jīng)高效液相色譜與蒸發(fā)光散射檢測器聯(lián)用法測定純度和分子量。峰型單一對稱，且純度達(dá)到99.54%，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出M-1的分子量為492 kDa。

圖4 M-1的高效液相色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of M-1

2.3.2 M-1的紫外-可見光光譜分析

根據(jù)圖5 UV-Vis掃描結(jié)果顯示，純化后的M-1在280 nm處存在一個(gè)肩峰，此處是蛋白的特征吸收峰。因此，表明M-1中含有蛋白質(zhì)，初步判斷M-1為糖蛋白。

圖5 M-1紫外-可見光光譜掃描Fig.5 UV-Vis scanning spectra of M-1

2.3.3 M-1中糖與蛋白的測定結(jié)果

表1列出了M-1的蛋白和總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)?？芍?，M-1是一種糖量相對較高的糖蛋白，其蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為34.13%，總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為55.81%。根據(jù)圖4與表1綜合判斷，可以確認(rèn)M-1為糖蛋白。

表1 M-1的蛋白和總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 1 Protein and carbohydrate contents of M-1

但是，M-1中尚有約10%未知物，有可能是有些組成成分未顯示測定糖與蛋白的反應(yīng)，或是其他原因，有待進(jìn)一步分析研究。

2.3 M-1的部分結(jié)構(gòu)解析

2.3.1 紅外光譜分析

圖6 M-1的紅外光譜圖Fig.6 Infrared spectrum of M-1

而3 406 cm-1處附近的強(qiáng)吸收峰，表明有O—H鍵和N—H鍵伸縮振動(dòng)而增寬的多重吸收峰；2 933 cm-1處是糖類的甲基、亞甲基等烷基C—H鍵的伸縮振動(dòng)峰；1 406 cm-1處是甲基、亞甲基的面內(nèi)變角振動(dòng)峰。M-1在1 039、1 071、1 095 cm- 1處有3個(gè)明顯而尖銳的吸收峰，這是吡喃環(huán)的特征峰；893 cm-1處較弱的吸收峰是β-型糖苷鍵C—H的特征吸收峰。這些都是多糖的特征吸收峰。

從上述兩個(gè)方面，證實(shí)M-1中含有蛋白和多糖的特征吸收峰，進(jìn)一步證實(shí)其為糖蛋白。

2.3.2 糖肽鍵的證實(shí)

澳洲堅(jiān)果糖蛋白M-1經(jīng)稀堿處理前后見圖7，可以看出樣品在未經(jīng)稀堿處理之前在240 nm的吸光值為0.397，經(jīng)β-消除反應(yīng)處理后在240 nm處的吸光值升到了0.736，出現(xiàn)了明顯的特征吸收，表明澳洲堅(jiān)果糖蛋白M-1存在O-糖肽鍵，并主要以O(shè)-糖肽鍵的形式鏈接。

圖7 堿處理前后紫外掃描光譜圖Fig.7 UV scanning spectra of M-1 before and after alkali treatment

當(dāng)糖蛋白中多糖鏈以O(shè)-糖肽鍵的形式與絲氨酸和蘇氨酸結(jié)合時(shí)，經(jīng)稀堿處理(β-消去反應(yīng)) 后，糖肽鍵發(fā)生解離，解離后的絲氨酸或蘇氨酸形成α-氨基丙烯酸或α-氨基丁烯酸，這兩種氨基酸在紫外波長 240 nm處有特征吸收。因此測定M-1在稀堿處理前后波長 240 nm處吸收的變化即可判斷是否含有O-糖肽鍵。

2.3.3 M-1中的單糖組成與比例

如圖8所示，根據(jù)單糖標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間和各單糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線，分析得出M-1主要由鼠李糖、半乳糖醛酸、半乳糖和阿拉伯糖組成，其摩爾比為1∶2.23∶3.88∶5.88，其摩爾比近似約為1∶2∶4∶6。

圖8 M-1 PMP衍生化的高效液相色譜圖Fig.8 High performance liquid chromatogram of PMP derivatization of M-1

2.4 M-1的抗氧化特性

2.4.1 總還原力的測定

如圖9所示，與Vc相比，M-1的還原力較弱，但隨著M-1樣品濃度的增加，其還原力也逐漸增加，當(dāng)濃度達(dá)到10 g/L時(shí)，其還原力最大。

圖9 M-1的總還原力Fig.9 Reducing power of M-1

還原力的大小即代表了M-1的抗氧化能力的強(qiáng)弱。Fe3+能夠接受溶液中抗氧化劑提供的電子，然后還原成Fe2+，同時(shí)Fe2+在波長700 nm處有最大吸收，其吸收強(qiáng)度與其含量呈定量關(guān)系。因此，700 nm處的吸光值反映了給電子能力的強(qiáng)弱，從而判斷M-1的抗氧化性。

2.4.2 DPPH自由基清除率測定

如圖10所示，2～10 g/L的M-1隨著樣品質(zhì)量濃度的升高，清除DPPH自由基的能力也逐漸升高，但明顯弱于Vc。當(dāng)濃度達(dá)到10 g/L時(shí)，清除率最高，此時(shí)清除率達(dá)到78.67%。證明M-1具有較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力。

圖10 M-1對DPPH自由基的清除作用Fig.10 DPPH radical-scavenging capacity of M-1

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基是一種帶有單電子的自由基，其乙醇溶液呈紫色并在波長525 nm處有強(qiáng)吸收。DPPH自由基能夠與單電子配對從而使其吸光度逐漸消失，其褪色程度也與其接受的電子數(shù)量成定量關(guān)系，因此可用525 nm波長處的吸光度表示DPPH自由基的清除能力。

通過測定M-1的總還原力和DPPH自由基清除率，表明M-1具有較好的抗氧化活性，且M-1的抗氧化作用與其結(jié)構(gòu)有關(guān)。M-1中蛋白質(zhì)部分的酚性氨基酸(如酪氨酸等)可能是產(chǎn)生自由基清除作用的原因。文獻(xiàn)表明，糖蛋白中蛋白質(zhì)的含量和組成在抗氧化作用中占有重要的地位[21]，推測M-1的抗氧化活性可能與其氨基酸組成有關(guān)；糖蛋白中多糖的糖苷鍵的鏈接方式[22]和單糖組成[23]也可能是影響其抗氧化作用的因素之一，M-1中含有的鼠李糖可能與其抗氧化活性有關(guān)。本文初步研究了M-1的部分結(jié)構(gòu)信息，對于影響M-1生物活性的氨基酸組成和糖苷鍵鏈接方式等高級結(jié)構(gòu)信息需待進(jìn)一步的研究。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過弱堿提取、乙醇分級沉淀、DEAE-52纖維素交換、葡聚糖凝膠G-100分離得到分子質(zhì)量為472 kDa的澳洲堅(jiān)果糖蛋白M-1。其多糖含量為55.81%，蛋白含量為34.13%。通過單糖組成分析實(shí)驗(yàn)得出澳洲堅(jiān)果糖蛋白單糖有鼠李糖、半乳糖醛酸、半乳糖和阿拉伯糖，其組成比例為1∶2∶4∶6，且可能具有益生元功能。β-消除反應(yīng)前紫外吸收的變化表明澳洲堅(jiān)果糖蛋白含有O-糖肽鍵。紅外光譜表明其含有糖和蛋白的特征吸收峰。根據(jù)其單糖的組成判斷，M-1應(yīng)具有增殖益生菌作用。通過測定總還原力和DPPH自由基清除率，表明澳洲堅(jiān)果糖蛋白在一定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有抗氧化活性。這些研究結(jié)果對進(jìn)一步深入研究M-1的分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、生物活性、開發(fā)利用等奠定了基礎(chǔ)。