李凱，王金晶，李永仙，李崎

(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122)

火龍果(Pitaya)又名青龍果、紅龍果、仙蜜果等，根據(jù)果皮與果肉顏色可分為紅皮白肉種(Hylocereusundatus)、紅皮紅肉種(Hylocereuscostaricensis)和黃皮白肉種(Hylocereusmegalanthus)，屬仙人掌科，量天尺(三角柱)屬的果用栽培品種，原產(chǎn)于中美洲熱帶雨林地區(qū)，后來傳入越南、東南亞國家和我國臺灣、福建、廣西等地[1-3]。這種熱帶水果含有豐富的營養(yǎng)成分，它除含有碳水化合物、有機酸、蛋白質(zhì)外，還有豐富的膳食纖維、維生素及多酚類物質(zhì)[4-6]，其中紅芯火龍果中還含有甜菜紅素、花青素等具有抗氧化作用的物質(zhì)[2,7-8]。

目前火龍果主要以鮮食為主，深加工產(chǎn)品較少，以火龍果為原料進行果酒發(fā)酵，不僅保留了火龍果本身的氨基酸、有機酸、礦物質(zhì)等成分[9]，而且發(fā)酵過程中酵母會產(chǎn)生多種對人體有益的代謝產(chǎn)物，且更容易被人體吸收。對于釀造企業(yè)而言，菌株是命脈，目前市售火龍果酒大多是一些小企業(yè)生產(chǎn)，除勾兌火龍果汁外多采用商業(yè)果酒酵母生產(chǎn)[10-15]，但往往出現(xiàn)發(fā)酵遲緩，發(fā)酵不徹底等問題。因此篩選適合火龍果酒發(fā)酵的專用酵母對工業(yè)生產(chǎn)具有重要意義。謝國芳等[16]通過TTC(2,3,5-氯化三苯基四氮唑)平板、杜氏小管、三角瓶發(fā)酵3步篩選，得到1株適合在火龍果原汁中發(fā)酵的果酒酵母。

因為火龍果果皮較厚，相比較其他多汁漿果，環(huán)境中的酵母菌發(fā)酵菌株很難與果肉接觸，篩選出性能較好的菌株相對困難。故本研究以多汁水果為篩選源，分離篩選適合釀造火龍果酒的優(yōu)良酵母，得到了1株發(fā)酵性能良好，香氣馥郁，風味優(yōu)良的菌株，并對其進行了鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅芯火龍果(產(chǎn)地越南)、白砂糖，市售；葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、瓊脂粉、酵母浸膏、氨芐青霉素、酸性磷酸鉀、硫酸鎂、檸檬酸、TTC，均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；酵母基因組DNA提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 培養(yǎng)基與菌種

TTC底層培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖50.5，蛋白胨10.0，酵母浸膏7.5，酸性磷酸鉀5.0，硫酸鎂2.0，檸檬酸1.35，氨芐青霉素1.0，調(diào)整pH在4.0以上，瓊脂30.0。

TTC上層培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖0.5，瓊脂15.0；滅菌后冷卻后加入TTC 0.5。

YPD培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20.0，蛋白胨20.0，酵母粉10.0。

YPD培養(yǎng)基平板、斜面(g/L)：葡萄糖20.0，蛋白胨20.0，酵母粉10.0，瓊脂粉20。

菌種：商業(yè)酵母D254作為對照。

1.3 儀器與設備

生化培養(yǎng)箱(BSP-250)、低溫水浴槽，上海博迅公司；阿貝折光儀，泰光有限公司；電子天平(PL2002)、分析天平(AL204)，梅特勒-托利多儀器有限公司；精密數(shù)顯pH計，北京Hanna公司；立式壓力蒸汽滅菌器，上海實驗儀器有限公司；高速冷凍離心機(5804R)、自動PCR儀，Eppendorf公司；氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀，賽默飛世爾科技有限公司。酵母基因組DNA提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司。

1.4 方法

1.4.1 菌種收集、初篩與分離

TTC是一種顯色劑，能與酵母中的脫氫酶反應而呈現(xiàn)紅色，且顏色的深淺和酵母體內(nèi)呼吸酶活力的大小，即酵母產(chǎn)酒精能力高低密切相關(guān)。將在特定的培養(yǎng)基上培養(yǎng)的酵母菌落上覆蓋1層含有TTC的固體培養(yǎng)基，TTC會附著在菌落表面，產(chǎn)酒精能力強的酵母會呈深紅色，次之顯粉紅色[17]。

以多汁水果為篩選源，收集菌體，稀釋涂布于含有氨芐青霉素的TTC下層平板上，28 ℃倒置培養(yǎng)2 d。保留菌株數(shù)在100左右的平板，倒入TTC上層平板，28 ℃避光培養(yǎng)2～3 h，挑選菌落較大、紅色較深的菌落于YPD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24～48 h，在YPD固體平板中劃線分離，挑選典型酵母形態(tài)單菌落(表面光滑、濕潤、黏稠，質(zhì)地柔軟，易挑起多為乳白色或奶油色)移接于YPD試管斜面28 ℃培養(yǎng)48 h，取出置4 ℃保藏。

1.4.2 菌株復篩

將斜面中保藏的菌株接種于YPD液體試管中28 ℃活化2 d后進行杜氏小管發(fā)酵試驗，火龍果汁的糖度為22 °Bx，以火龍果汁的體積計算，接種量為5%，在25 ℃靜置培養(yǎng)，觀察各菌株的產(chǎn)氣速度和產(chǎn)氣量，挑選出發(fā)酵能力強且發(fā)酵香氣宜人的菌株。

1.4.3 菌株發(fā)酵試驗

將試管斜面保藏的菌株接種至YPD液體培養(yǎng)基中28 ℃活化2 d，轉(zhuǎn)接入糖度為22 °Bx的火龍果汁中，25 ℃發(fā)酵，根據(jù)發(fā)酵過程中二氧化碳失重，發(fā)酵結(jié)束時的酒精含量及感官品評，挑選出最終發(fā)酵能力、酒精含量、香氣較佳的酵母菌株。

香氣感官品評：由江南大學經(jīng)過感官品評專業(yè)培訓的師生組成品酒小組，根據(jù)表1的評分標準品評發(fā)酵結(jié)束后的濾液，得出火龍果酒的香氣評分結(jié)果。

表1 火龍果酒香氣評價表(總分10分)Table 1 Aroma evaluation standard of pitaya wine

1.4.4 菌株發(fā)酵香氣分析

將上述保留菌株活化后按1×107CFU/mL的接種量接入含糖22 °Bx的火龍果汁中，25 ℃發(fā)酵，每天監(jiān)測二氧化碳失重，發(fā)酵結(jié)束測定果酒酒精度及利用氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)分析火龍果酒酒的香氣成分，并對其進行感官品評。

樣品前處理萃取條件：20 mL頂空瓶中，加入8 mL火龍果酒樣品，3.0 g NaCl，在45 ℃預熱5 min，萃取60 min。萃取完成后，將萃取頭插入進樣口，解吸附5 min，進行GC-MS分析，實驗以2-辛醇為內(nèi)標作半定量分析。

分析條件為：GC條件：PEG-20M彈性石英毛細管柱，30 m×0.25 m×0.25 μm；載氣為高純氦氣，恒定流量為0.8 mL/min；升溫程序：從180 ℃開始，保持2 min，以3 ℃/min升溫到230 ℃，保持10 min；進樣口溫度250 ℃，出樣口溫度200 ℃；檢測電壓350 V。MS條件：EI離子源，發(fā)射電流200 μA，電子能量70 eV，掃描范圍20～550 U。

1.4.5 菌株鑒定

挑取斜面保藏的菌株于10 mL YPD培養(yǎng)基中， 28 ℃ 150 r/min培養(yǎng)24 h。取適量培養(yǎng)液離心 1 min (12 000 r/min)，棄上清，采用酵母DNA提取試劑盒提取菌體DNA，用酵母ITS通用引物(引物序列見表2)擴增基因組DNA，PCR產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并進行測序。采用BLAST方式將測定的18S rDNA序列與GenBank中酵母菌的序列進行比對，構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育樹。

表2 酵母ITS通用引物序列Table 2 Common primer sequences of yeast

1.4.6 菌株生長曲線測定

將在斜面保藏的菌株在YPD培養(yǎng)基中活化24 h，以10%的接種量接種于YPD三角瓶中，28 ℃培養(yǎng)測定生長曲線，前期每小時取樣，將菌液離心去上清，用無菌水重懸，并稀釋適當倍數(shù)(吸光值0.2～0.8)在600 nm下測定其吸光值，進入穩(wěn)定期后每2 h測定1次。每次取3個平行。

1.4.7 菌株耐受性實驗

分別給與菌株不同生長條件，考察菌株的耐受性[18]。按表3所列的生長條件及各壓力梯度將火龍果汁進行調(diào)整，分別裝入帶有杜氏小管試管中。將斜面中保藏的菌株接種于YPD液體試管中28 ℃活化2 d后接入杜氏小管發(fā)酵，以火龍果汁的體積計算，接種量為5%， 25 ℃靜置培養(yǎng)，觀察菌株在不同壓力下的產(chǎn)氣情況，每個條件均做3個平行。

表3 酵母菌株生長條件及各條件物質(zhì)濃度梯度Table 3 Growth pressure of yeast and the

2 結(jié)果與分析

2.1 TTC平板初篩

產(chǎn)酒精能力是評價酵母性能的重要指標之

一。將從不同水果表面收集的菌體分別進行適當稀釋后涂布到TTC篩選平板，每種水果涂布3個TTC平板，挑選在TTC平板(如圖1)上菌落較大、顏色較深的菌落進一步于YPD固體平板劃線中分離，挑出典型的酵母菌菌落(表面光滑、濕潤、黏稠，質(zhì)地柔軟，易挑起，多為乳白或奶油色[19])200株，經(jīng)YPD試管斜面培養(yǎng)后4℃保藏備用，菌株來源見表4。

圖1 TTC初篩平板Fig.1 TTC chromogenic media注：產(chǎn)酒精能力強的菌株菌落顏色為深灰，次之為淺灰，白色為不產(chǎn)酒精的菌株

表4 菌株來源Table 4 The sources of the screened strains

菌株編號菌株來源菌株編號菌株來源菌株編號菌株來源菌株編號菌株來源1～52火龍果133～134草莓160-174香蕉197～200黑布林53～80梨135-140車厘子175-180李子81～126獼猴桃141-148西瓜181～186芒果127～132圣女果149-159葡萄187～196櫻桃

2.2 菌株的復篩

菌株發(fā)酵產(chǎn)氣量的多少與其發(fā)酵能力的大小有關(guān)。本研究采用杜氏小管進行菌株的復篩。將從TTC顯色平板挑出的菌株在YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)到穩(wěn)定期后，以5%的接種量接種于無菌火龍果果汁中，25 ℃培養(yǎng)48 h，根據(jù)產(chǎn)氣量和發(fā)酵液的香氣特征，選出產(chǎn)氣量較多(產(chǎn)氣量為+++，菌株產(chǎn)氣情況見表5)且發(fā)酵液香氣較好(無異雜味，具有酒香、果香或發(fā)酵香)的菌株70株進行后續(xù)的研究。

表5 菌株杜氏小管產(chǎn)氣結(jié)果Table 5 Results of CO2 release of the strains

注：“-”為不產(chǎn)氣，“+”為產(chǎn)氣高度≤1/2，“++”為產(chǎn)氣高度≥1/2， “+++”為充滿杜氏小管。

2.3 菌株的三角瓶發(fā)酵

產(chǎn)酒精能力的強弱是評價果酒酵母性能的一個重要指標，行業(yè)規(guī)定果酒酒精度范圍7%～18%[20]。利用葡萄酒生產(chǎn)酵母D254為對照菌株，將復篩所得的70株酵母進行火龍果果汁的三角瓶發(fā)酵。將菌株經(jīng)YPD培養(yǎng)到穩(wěn)定期后，接種到22 °Bx的火龍果果汁中，25 ℃發(fā)酵7 d，接種量為5%，發(fā)酵結(jié)束測定其酒精度，結(jié)果見表6。結(jié)果顯示，其酒精度在10.0%以上的菌株有36株，對照菌D254發(fā)酵后果酒酒精度為11.2%。對酒精度≥7%的50株菌發(fā)酵的果酒進行香氣品評，挑選出香氣評分較高的15株菌。

表6 菌株發(fā)酵產(chǎn)酒精能力Table 6 Results of alcohol production capacity ofthe strains

2.4 菌株發(fā)酵能力及香氣物質(zhì)的比較

將挑選出的15株菌株繼續(xù)進行火龍果果汁的三角瓶發(fā)酵，每株菌做3個平行。三角瓶裝液量為60%，火龍果果汁糖度為22 °Bx，發(fā)酵起始時的酵母濃度為1×107個/mL，25 ℃發(fā)酵。發(fā)酵過程中每24 h測定二氧化碳失重，發(fā)酵結(jié)束測酒精含量、風味物質(zhì)并進行感官品評。結(jié)果如圖2及表7。

圖2 篩選菌株發(fā)酵失重圖Fig.2 Screening strains loss weight during fermentation

菌株的起酵速度與發(fā)酵周期是考察該菌株優(yōu)劣的指標之一。生產(chǎn)過程中菌株起酵速度快，可快速形成生長優(yōu)勢，發(fā)酵周期短，可增加生產(chǎn)批次，提高設備利用率。通過各菌株發(fā)酵過程失重曲線的斜率可以判斷菌株發(fā)酵速率，斜率越大發(fā)酵速度越快。結(jié)果表明，菌株發(fā)酵到第2天，有9株菌的二氧化碳失重大于對照菌株，其中194號菌的起酵速度最大，兩天的失重為9.34 g，是D254的1.67倍。發(fā)酵結(jié)束后，測定果酒的酒精度、風味物質(zhì)含量(相對于內(nèi)標2-辛醇)及香氣感官品評，結(jié)果見表7。

表7 不同菌株發(fā)酵的火龍果酒酒精度、風味物質(zhì)含量及香氣品評Table 7 The contents of alcohol and flavor substances, and aroma evaluation of dragon fruit winefermented by different strains

注：同一列中不同字母表示組間顯著差異(P<0.05)。

通過GC-MS檢測分析可知，構(gòu)成果酒主要香氣成分物質(zhì)主要有醇類、酯類、酸類、酮醛類及萜烯類化合物，其中酯類、醇類和酸類，占總揮發(fā)物質(zhì)的92%以上；酯類物質(zhì)對果酒的香味起著積極作用，會給果酒帶來類似水果及鮮花等香氣[21]；高級醇是酒精飲料中另一類重要的揮發(fā)性香氣物質(zhì)，適量的高級醇會給果酒帶來濃郁芬芳的感官，若含量過高會使酒體產(chǎn)生不愉快的味道，并且還容易引起飲后“上頭”[22]；適量的有機酸會使果酒具有爽口感，不足則會使得果酒顯得黏稠、不爽口，但是過高會使酒體口感粗糙、有銳利感、不協(xié)調(diào)[23]。15株菌中酯類含量較高的有19、33、44、194，其中19與33號菌株的高級醇類含量較高，帶有肉味，整體評價得分不高；而44號菌株的酸類含量較高，感官評價酸味較重；194號菌株高級醇類、酸類含量適中，感官評價酒體協(xié)調(diào)，發(fā)酵香氣濃郁，同時帶有火龍果的清香。

綜合以上結(jié)果，194號菌株更適合火龍果酒的釀造，其發(fā)酵后的火龍果酒酒體香氣馥郁且具有典型火龍果香氣。

2.5 菌株鑒定

2.5.1 菌株鑒定

如圖3所示，菌株194的基因組DNA擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢驗條帶清晰。將測序結(jié)果與Genbank中酵母菌的18S rDNA序列比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖4所示，菌株194與釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)同源性為100%，可確定該菌株為釀酒酵母。對該菌株進行菌落和細胞形態(tài)觀察，菌落呈大小不一的乳白色凸起，邊緣較整齊，挑起粘連；細胞形態(tài)呈卵圓形，一端或兩端出芽。

圖3 酵母18S rDNA PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖Fig.3 PCR analysis of yeast 18S rDNA

圖4 基于18S rDNA測序構(gòu)建酵母菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylodenetic tree of Saccharomyces cerevisiaebased on 18S rDNA sequencing

2.5.2 菌株生長曲線測定

由圖5可以看出，酵母菌株194在培養(yǎng)到1 h之后就開始進入對數(shù)生長期，在第7 h后開始進入穩(wěn)定期，說明該菌株的生長性能較強。

圖5 菌株194生長曲線Fig.5 Growth curve of yeast 194

2.5.3 菌株耐受性研究

分別給與菌株不同的壓力，考察菌株的耐受性，表8為菌株在25 ℃下發(fā)酵24 h時的產(chǎn)氣情況。

果酒釀造過程中，酒精發(fā)酵的基礎是糖，但是高濃度的糖會抑制酵母菌株的生長；由表8可以看出，當果汁糖度低于30 °Bx時，菌株的發(fā)酵速度較快，但當糖度為35 °Bx時，菌株的發(fā)酵速度明顯受到抑制，說明菌株194可以耐受較高的糖度，符合一般酵母菌酒精發(fā)酵的糖度12～20 °Bx[24]。菌株的生長環(huán)境的pH過高或者過低都會影響酵母的生長，一般火龍果汁的pH為4.7左右，故考慮菌株194在pH<4.5的耐受性；當初始pH在2.5時，菌株的生長受到明顯的抑制，當初始pH≥3時，菌株發(fā)酵速度較快，說明菌株194具有較強的耐酸能力[25]。一般而言，SO2的添加可以抑制各類雜菌的生長及繁殖，國標中SO2的最高使用量為250 mg/L，故考慮菌株在低于250 mg/L時的耐受性；菌株194在250 mg/L時仍有較高的發(fā)酵能力，說明194具有較強的SO2耐受性。最后考察了菌株194的耐酒精能力，耐酒精能力強的菌株可以發(fā)酵更加完全、徹底，從而提高酒的酒精度；菌株在酒精體積分數(shù)為14%時仍具有較高的發(fā)酵性能，說明該菌株具有強的酒精耐受能力，但當酒精度≥16%時,均不產(chǎn)氣。

表8 菌株194在不同生長條件下的產(chǎn)氣情況Table 8 Gas production of strain 194 under differentgrowth conditions

注：“-”為不產(chǎn)氣，“+”為產(chǎn)氣高度≤1/2，“++”為產(chǎn)氣高度≥1/2， “+++”為充滿杜氏小管。

3 討論

評價1株釀酒酵母的優(yōu)劣主要包括菌的良好發(fā)酵性能，較強的耐受性和發(fā)酵產(chǎn)品香氣的豐富性及協(xié)調(diào)性[26]。目前關(guān)于火龍果酒釀酒酵母篩選的報道，大多是從商業(yè)菌株中篩選適合火龍果酒釀造的菌株，鮮有火龍果酒專用酵母的篩選與研究。所以，本文在前人的研究基礎上，以多汁漿果為篩選源，使用TTC雙層平板挑選出具有酒精產(chǎn)生能力的菌株；杜氏小管挑選出發(fā)酵能力較強且具有良好香氣的菌株；三角瓶發(fā)酵挑選出起酵速度快、酒精度較高、香氣濃郁的菌株，分析過程中利用感官品評與儀器檢測(GC-MS)結(jié)合，可以從酒體風味協(xié)調(diào)性及具體風味物質(zhì)綜合評價酵母性能。綜合以上結(jié)果，并與商業(yè)酵母D254相比，挑選出的菌株194起酵速度快、產(chǎn)酒精能力較強且果酒香氣濃郁、典型性好。通過18S rDNA序列比對，鑒定其為釀酒酵母，并且該菌株具有較強的生長能力及耐高糖、高酒精度、高酸、高SO2能力；該菌株在22 °Bx火龍果汁中，25 ℃發(fā)酵7 d，可產(chǎn)生11.75%的酒精，且這株酵母釀造的火龍果酒香氣優(yōu)雅，口感協(xié)調(diào)且火龍果典型性明顯，具有較強的工業(yè)應用前景。該菌株發(fā)酵的火龍果酒香氣特征及主要風味物質(zhì)需進一步研究。