李軍，涂宗財,2*，沙小梅，張露，葉云花，羅娟，楊萍，邵艷紅

1(江西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，江西 南昌,330022) 2(食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(南昌大學(xué))，江西 南昌,330047)

美拉德反應(yīng)(maillard reaction，MR)又稱為非酶褐變反應(yīng)，是指含氨基化合物(氨基酸、蛋白質(zhì))和含羰基化合物(還原糖、醛)之間發(fā)生的復(fù)雜反應(yīng)[1]，該反應(yīng)在蛋白質(zhì)和還原糖之間自發(fā)進(jìn)行，無需添加任何化學(xué)物質(zhì)。相對化學(xué)改性和酶法改性而言，基于MR機(jī)理的糖基化改性是食品蛋白質(zhì)改性的一種綠色、有效的方法，已被人們廣泛應(yīng)用于食品加工領(lǐng)域，成為食品科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。高蛋白和高糖類食品在熱加工過程中發(fā)生的糖基化反應(yīng)可以促進(jìn)食品風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生，增加口感，賦予食品色澤，增加美觀程度[2]，還能提高蛋白質(zhì)的抗氧化活性等性質(zhì)[3]。但當(dāng)糖基化反應(yīng)處于中期和晚期階段時，還原酮、醛和雜環(huán)化合物等一系列有害的糖基化產(chǎn)物也會隨之產(chǎn)生，進(jìn)而對人體健康造成不良的影響。如DAGLIA等[4]研究發(fā)現(xiàn)羰基化合物可以造成細(xì)胞損傷，進(jìn)而導(dǎo)致糖尿病及人體衰老；SACHSE等[5]研究發(fā)現(xiàn)，5-羥甲基糠醛具有致癌作用；張娟等[6]研究發(fā)現(xiàn)，高劑量的丙烯酰胺對雄性小鼠的睪丸細(xì)胞DNA有損傷作用；孫緬恩等[7]研究發(fā)現(xiàn)，食用過多含后期糖基化末端終產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)的食品可加速人體衰老，增加糖尿病、動脈粥樣硬化和阿爾茨海默癥等各種慢性退化疾病的發(fā)病率。因此，通過控制糖基化反應(yīng)條件，降低食品加工過程中有害糖基化產(chǎn)物的形成具有重要的意義。

牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)是一種簡單的球蛋白，其作為牛血清中的主要成分，在食品、醫(yī)藥和生化領(lǐng)域中均有廣泛的應(yīng)用。它作為動物來源的一種代表性蛋白，已經(jīng)成為研究生物學(xué)功能、蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、蛋白質(zhì)與小分子相互作用等方面的一種理想蛋白模型。因此，本文以BSA-葡萄糖體系為簡單模型來研究糖基化體系在熱加工過程中糖基化產(chǎn)物形成的變化，研究反應(yīng)時間和溫度的變化對糖基化產(chǎn)物，尤其是有害糖基化產(chǎn)物形成的影響，為食品熱加工過程中糖基化產(chǎn)物形成的調(diào)控提供一定科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)、葡萄糖：分析純，美國Sigma公司；糖化血清蛋白(GSP)測定試劑盒(果糖胺法)，南京建成生物工程研究所；5-羥甲基糠醛(5-hydroxymethylfurfural，HMF)、丙烯酰胺：色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；2,4-二硝基苯肼(2,4-dinitrophenylhydrazine，DNPH)、三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)、異硫氰酸胍、鹽酸等：分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

納米超高壓均質(zhì)機(jī)(NCJJ-0.007/200)，廊坊通用機(jī)械制造有限公司；酶標(biāo)儀(Synergy H1)，美國Bio Tek公司；熒光分光光度儀(F-7000型)，日本日立公司；冷凍干燥機(jī)(LGJ-1D-80)，北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9023A)，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；電子分析天平(FA1104N型)，上海丙林電子科技有限公司；Infinity Quaternary LC(Agilent 1260)，美國安捷倫公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品的制備

參照LIU等[8]的方法制備BSA-葡萄糖糖基化樣品。將BSA溶解于磷酸緩沖液(20 mmol/L，pH 7.4)中配成25 g/L的溶液，按照葡萄糖與蛋白質(zhì)質(zhì)量比為1∶1的比例向BSA溶液加入葡萄糖，混勻，凍干。將凍干的粉末置于恒溫烘箱中55 ℃下分別反應(yīng)6、12、24、36、48、72 h，或分別于50、60、70、80、90、100 ℃下反應(yīng)12 h。烘箱內(nèi)的相對反應(yīng)濕度均為65%(飽和KI溶液)。待反應(yīng)結(jié)束后，將BSA-葡萄糖糖基化樣品置于冰水浴中終止反應(yīng)，加入超純水復(fù)溶到BSA的質(zhì)量濃度為10 g/L，并置于4 ℃冰箱中待測。

1.2.2 褐變程度的測定

參照J(rèn)UNG等[1]的方法測定不同反應(yīng)條件下BSA-葡萄糖體系在294 nm以及420 nm處的吸光值。

1.2.3 果糖胺含量的測定

采用GSP試劑盒測定BSA-葡萄糖糖基化體系中的果糖胺含量，在530 nm波長處測定樣品的吸光值。其中，標(biāo)準(zhǔn)溶液和標(biāo)準(zhǔn)空白溶液以試劑盒的方法配制。GSP含量的計算見公式(1)。

(2 mol/L)

(1)

1.2.4 羰基含量的測定

根據(jù)文獻(xiàn)[9]略作修改：取0.2 mL稀釋到適宜濃度的樣品與0.8 mL 0.1%的DNPH溶液(2.5 mol/L鹽酸配制)充分混合，室溫避光反應(yīng)1.5 h。然后加入1 mL 20%的TCA，10 000 r/min離心10 min后棄上清液，得到的沉淀物用1 mL蒸餾水重新溶解，加入1 mL 10%的TCA，再次10 000 r/min離心10 min，棄上清液。沉淀物用1 mL 1∶1(V∶V)的乙酸乙酯-乙醇溶液洗滌2次,以除去未反應(yīng)的有機(jī)試劑。最后將沉淀物溶于0.5 mL 6 mol/L的異硫氰酸胍溶液中，在370 nm處測定樣品的吸光值，并計算糖基化產(chǎn)物的羰基含量。

1.2.5 5-羥甲基糠醛含量的測定

根據(jù)文獻(xiàn)[10]略作修改：用超純水配制質(zhì)量濃度分別為4、8、10、15、20、30和40 μg/mL的5-HMF標(biāo)準(zhǔn)品溶液，過0.22 μm水系濾膜后進(jìn)行高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)上樣分析。取1 mL稀釋到適宜濃度的樣品溶液至15 mL離心管中，加入100 μL 6 mol/L的鹽酸混勻，煮沸15 min后，4 000 r/min離心20 min。最后取上清液過0.22 μm水系濾膜后HPLC上樣分析。色譜柱：Phenomenex C18長柱(5 μm，150 mm×4.6 mm)；流動相：V(甲醇)∶V(水)=30∶70；流速0.4 mL/min；柱溫：25 ℃；紫外檢測波長285 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

1.2.6 丙烯酰胺含量的測定

根據(jù)文獻(xiàn)[11]略作修改：用超純水配制質(zhì)量濃度0.5、1、2、3、5、10、20、30和50 μg/mL的丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液，過0.22 μm水系濾膜后進(jìn)行HPLC分析。取1 mL稀釋到適宜濃度的樣品溶液，8 000 r/min離心20 min，取上清液過0.22 μm水系濾膜后進(jìn)行HPLC分析。色譜柱：Phenomenex C18長柱(5 μm，150 mm×4.6 mm)；流動相：V(甲醇)∶V(水)=5∶95；流速0.4 mL/min；柱溫：30 ℃；紫外檢測波長205 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

1.2.7 熒光性AGEs測定

根據(jù)文獻(xiàn)[12]修改如下：取3 mL稀釋到適宜濃度的樣品溶液，采用F-7000熒光分光光度計測定其在激發(fā)波長370 nm，發(fā)射波長440 nm處的熒光強(qiáng)度，激發(fā)和發(fā)射波長的狹縫寬度均為5 nm，掃描速度為1 200 nm/min，電壓為400 V。樣品的熒光強(qiáng)度單位以任意單位(arbitrary units)表示。

1.2.8 類黑精含量的測定

根據(jù)文獻(xiàn)[13]修改如下：將樣品溶液稀釋到適宜的濃度，測定其在470 nm處的吸光值，通過Lamber-Beer等式計算樣品中類黑精的含量，其計算等式見公式(2)。

(2)

式中：c,類黑精的濃度(mmol/L)；A,樣品的吸光度(470 nm)；V,體積(mL)；e,類黑精的摩爾消光系數(shù)282 L/(mol·cm)；b，比色皿厚度(cm)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，采用Origin 8.6軟件作圖，SPPS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)。P<0.05則認(rèn)為樣品間具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 褐變程度分析

糖基化樣品在294 nm處的吸光值常被用來監(jiān)測糖基化反應(yīng)的初始速度，代表中間產(chǎn)物生成的量；而在420 nm處的吸光值可以用來反映末期產(chǎn)物的生成量[14-15]。不同反應(yīng)時間和反應(yīng)溫度制備的BSA-葡萄糖糖基化體系在294 nm和420 nm處的吸光值如圖1所示。當(dāng)糖基化反應(yīng)時間為6～48 h時，樣品的吸光值隨反應(yīng)時間的延長逐漸增大，而超過48 h時，吸光值隨反應(yīng)時間的延長逐漸下降，即55 ℃下反應(yīng)超過12 h時，吸光值大幅度增加，反應(yīng)48 h的樣品在294 nm和420 nm處吸光值最高(P<0.05)，分別為3.171和0.600。隨著反應(yīng)溫度的升高，樣品在294 nm和420 nm處的吸光值呈增加的趨勢，即在本次實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)反應(yīng)溫度超過60 ℃時，吸光值大幅度增加，反應(yīng)溫度達(dá)到100℃時，其在294 nm和420 nm的吸光值達(dá)到最大值，分別為5.033和0.688，且顯著高于50 ℃下制備的樣品(P<0.05)。

圖1 反應(yīng)時間(A)和反應(yīng)溫度(B)對BSA-葡萄糖體系在294nm和420nm處的紫外吸收的影響Fig.1 Effect of reaction time (A) and temperature (B) on the UV absorption of the BSA-glucose system at 294 nm and 420 nm注：不同小寫字母表示樣品在294 nm之間存在顯著性差異(P<0.05)；不同大寫字母表示樣品在420nm之間存在顯著性差異(P<0.05)

樣品在294 nm處的吸光值可用于評價糖基化反應(yīng)中間產(chǎn)物的形成量。在糖基化反應(yīng)的初始階段，葡萄糖脫水形成在294 nm有紫外吸收的中間產(chǎn)物并積累導(dǎo)致吸光值增加。但隨著反應(yīng)時間的延長或反應(yīng)溫度的升高，反應(yīng)物逐漸被消耗，中間產(chǎn)物的積累速度變慢，吸光值增加緩慢。當(dāng)糖基化反應(yīng)到了最終階段，長時間的反應(yīng)讓中間產(chǎn)物通過聚合逐漸形成最終產(chǎn)物，使反應(yīng)72 h后體系的吸光值降低，這和AJANDOUZ等[15]報道相似。糖基化產(chǎn)物在420 nm和294 nm處的吸光值具有相似的變化趨勢，這與中間階段反應(yīng)產(chǎn)物是最終階段反應(yīng)產(chǎn)物的前體物質(zhì)有關(guān)[16]。但在反應(yīng)后期，樣品在420 nm處的吸光值變化不大甚至下降，這可能是由于生成越來越多不溶于水的類黑精所致。

2.2 果糖胺含量的分析

果糖胺是蛋白質(zhì)進(jìn)行非酶糖化而形成的糖化蛋白。高蛋白食品熱加工過程中都會產(chǎn)生果糖胺，食用過多含果糖胺的食品會導(dǎo)致人體血糖偏高[17]。由圖2可知，糖基化樣品中的果糖胺含量隨反應(yīng)時間的延長和反應(yīng)溫度的升高均呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(P<0.05)。

圖2 反應(yīng)時間(A)和反應(yīng)溫度(B)對BSA-葡萄糖體系中果糖胺濃度的影響Fig.2 Effect of reaction time (A) and temperature (B) on the content of fructosamine of BSA-glucose glycation system注：不同小寫字母表示樣品之間存在顯著性差異(P<0.05)。下同。

在反應(yīng)時間超過12 h和反應(yīng)溫度高于60 ℃時，果糖胺含量大幅度增加，并分別在24 h(2.36 mmol/L)和70 ℃(1.99 mmol/L)達(dá)到最大值。果糖胺含量增加的原因可能是，在反應(yīng)初始階段，希夫堿環(huán)化形成相應(yīng)的葡糖胺，經(jīng)過分子重排后形成了果糖胺。但繼續(xù)延長反應(yīng)時間或升高反應(yīng)溫度，果糖胺逐漸被消耗形成類黑精而導(dǎo)致果糖胺含量下降[18]。雖然55 ℃反應(yīng)72 h或100 ℃反應(yīng)12 h制備的糖基化體系的果糖胺含量達(dá)到最低，但隨著反應(yīng)時間和高溫的增加，反應(yīng)速率加快，反應(yīng)程度加深，其有害糖基化末期產(chǎn)物增加，對人體健康存在更大的威脅[19-20]。因此，在蛋白質(zhì)類食品加工過程中，將糖基化反應(yīng)溫度和時間應(yīng)分別控制在60 ℃和12 h以內(nèi)，能有效降低食品中果糖胺的含量。

2.3 羰基含量分析

羰基含量反映MR中間階段羰基化合物形成的量，可通過測定樣品中羰基含量來判斷食品中蛋白質(zhì)是否被氧化[21]。由圖3可以看出，糖基化樣品中的羰基含量隨反應(yīng)時間的延長和反應(yīng)溫度的升高均呈先增加后下降的趨勢(P<0.05)。當(dāng)糖基化反應(yīng)在6～36 h和50～70 ℃內(nèi)，羰基含量明顯增加，且在12 h和60 ℃大幅度增加，這是因?yàn)殡S著反應(yīng)程度的增加，BSA與葡萄糖反應(yīng)形成大量的羰基化合物[22]。但繼續(xù)延長反應(yīng)時間或者提高反應(yīng)溫度，羰基含量逐漸減少，這可能是因?yàn)轸驶衔镒鳛镸R最終階段產(chǎn)物的前體物質(zhì)，被消耗形成對人體有害的末期產(chǎn)物所致[9]。因此，將糖基化反應(yīng)的溫度和時間應(yīng)分別控制在60 ℃和12 h以內(nèi)，可以有效地控制羰基化合物的形成，提高食品的相對安全性。

圖3 反應(yīng)時間(A)和反應(yīng)溫度(B)對BSA-葡萄糖體系中羰基濃度的影響Fig.3 Effect of reaction time (A) and temperature (B) on the content of carbonyl groups of BSA- glucose system

2.4 5-羥甲基糠醛含量的分析

本研究以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，5-HMF的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，繪制5-HMF的標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=129.36X-64.064(R2=0.999 2)，表明峰面積Y與5-HMF的質(zhì)量濃度X(μg/mL)具有良好的線性關(guān)系，可用于計算樣品中5-HMF的含量。

5-HMF是一種具有呋喃環(huán)結(jié)構(gòu)的糠醛化合物，廣泛存在于咖啡、焦糖制品、焙烤等食品中，可以改變食品的風(fēng)味，已經(jīng)被看作是帶有微弱致癌性的一種指標(biāo)成分。在人體內(nèi)，5-HMF可以代謝產(chǎn)生毒性更強(qiáng)的羥甲基糠醛酸、羥甲基糠醛次硫酸鹽等物質(zhì)，具有很強(qiáng)的致癌致突變性[23]。反應(yīng)時間和溫度對樣品中5-HMF含量的影響如圖4所示，當(dāng)反應(yīng)溫度為55 ℃時，樣品中5-HMF含量隨著反應(yīng)時間的延長逐漸增加(P<0.05)，反應(yīng)時間≤24 h時，5-HMF含量增加幅度較大，從6 h的36.10 μg/mL增加到了24 h的106.13 μg/mL。當(dāng)糖基化時間為12 h時，5-HMF含量隨反應(yīng)溫度的升高呈先增加后下降的趨勢，50 ℃時形成較少，含量為21.60 μg/mL，超過50 ℃時5-HMF大幅度增加，在70 ℃達(dá)到最大值(167.31 μg/mL)，當(dāng)反應(yīng)溫度超過70 ℃，5-HMF含量下降，且80～100 ℃反應(yīng)12 h制備的樣品中5-HMF含量無顯著性差異(P>0.05)，這可能是因?yàn)?-HMF含量的變化是其形成和降解共同作用，隨著糖基化反應(yīng)的進(jìn)行，在己糖脫水形成5-HMF的同時，5-HMF與其他化合物反應(yīng)生成類黑精等后期產(chǎn)物[22]。江姍姍等[10]研究表明，谷氨酸、賴氨酸、甘氨酸、半甘氨酸與葡萄糖的糖基化體系中5-HMF含量均隨著加熱時間的延長而增加。這一方面可能是因?yàn)榘被崤c葡萄糖體系的反應(yīng)時間，最長反應(yīng)時間僅為30 min，另一方面可能是因?yàn)锽SA分子含有巰基，生成的5-HMF更容易被降解[10]。因此，將反應(yīng)溫度和時間分別控制在60 ℃和12 h以內(nèi)，可有效降低糖基化體系中5-HMF含量。

圖4 反應(yīng)時間(A)和反應(yīng)溫度(B)對BSA-葡萄糖體系中5-羥甲基糠醛含量的影響Fig.4 Effect of reaction time (A) and temperature (B) on the content of 5-HMF of BSA-glucose system

2.5 丙烯酰胺含量的分析

本研究以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，丙烯酰胺的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=456.58X-122.26(R2=0.998 4)。表明方程式的線性關(guān)系良好，可用于計算樣品中丙烯酰胺的含量。

丙烯酰胺是MR的中間產(chǎn)物，在國際上被認(rèn)為是一類食源性有毒物質(zhì)。動物實(shí)驗(yàn)表明，丙烯酰胺對動物有神經(jīng)毒性、生殖毒性，而且對嚙齒類動物具有致癌性[24-25]。被國際癌癥研究中心列為“人類可能的致癌物”[26]。反應(yīng)時間和溫度對樣品中丙烯酰胺含量的影響如圖5所示，延長反應(yīng)時間和升高反應(yīng)溫度，均會增加樣品中丙烯酰胺的含量(P<0.05)。且溫度對丙烯酰胺形成的影響大于反應(yīng)時間。當(dāng)反應(yīng)時間≤24 h，反應(yīng)溫度≤80 ℃時，樣品中丙烯酰胺的含量明顯增加，表明此時丙烯酰胺在大量生成并逐漸積累，但隨著糖基化反應(yīng)的持續(xù)進(jìn)行，樣品中丙烯酰胺的含量增加不明顯，且無顯著性差異(P>0.05)，這和WEDZICHA等[27]報道的結(jié)果一致，這是因?yàn)楸０繁旧斫到饣蚝推渌镔|(zhì)發(fā)生反應(yīng)導(dǎo)致其含量沒有增加。丁曉雯等[11]研究也表明油條中丙烯酰胺的含量隨著油炸時間和溫度的增加呈先增加后下降的趨勢，油炸溫度為160～200 ℃，油炸時間為3～5 min時，油條中產(chǎn)生的丙烯酰胺最多(134.15 μg/kg)。因此，將反應(yīng)溫度和時間控制在60 ℃和12 h以內(nèi)，可有效減少糖基化體系中丙烯酰胺的含量。

圖5 反應(yīng)時間(A)和反應(yīng)溫度(B)對BSA-葡萄糖體系中丙烯酰胺含量的影響Fig.5 Effect of reaction time (A) and temperature (B) on the content of acrylamide of BSA-glucose system

2.6 熒光性AGEs含量的變化

糖基化末端終產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)是指MR后期生成一類不可逆的有害糖基化終產(chǎn)物，主要是通過羰基化合物和氨基化合物經(jīng)過復(fù)雜的反應(yīng)生成熒光性AGEs。膳食是人體中AGEs的主要來源，AGEs在人體中的大量積累可導(dǎo)致糖尿病、尿毒癥、動脈粥樣硬化和阿爾茨海默癥等疾病的發(fā)生[28-29]。如圖6所示，當(dāng)反應(yīng)溫度為55 ℃時，AGEs含量隨著反應(yīng)時間的延長呈先增加后下降的趨勢，且在48 h達(dá)到最大值，約為6 h的4.6倍；當(dāng)反應(yīng)時間為12 h時，在50～80 ℃時，反應(yīng)體系中AGEs含量大幅度增加，并在80 ℃達(dá)到最大值，約為50 ℃的12.8倍。表明隨著反應(yīng)時間的延長和反應(yīng)溫度的升高會促進(jìn)糖類物質(zhì)發(fā)生羥醛縮合生成羰基化合物，進(jìn)而形成的AGEs也越多。但隨著反應(yīng)時間和反應(yīng)溫度的逐漸增加，樣品的顏色加深，熒光值降低，這可能是在末期階段中的羰基含量下降或熒光性AGEs逐漸生成了棕色的類黑精所致。根據(jù)房紅娟等[12]的研究，BSA-葡萄糖模擬體系中AGEs含量也是隨著加熱時間的延長和加熱溫度的升高具有先增加后減少的趨勢，表明熒光性AGEs聚合形成無熒光性的AGEs，并不是隨著反應(yīng)程度的加深而一直增加。在本次實(shí)驗(yàn)中，AGEs含量雖然在72 h和100 ℃有所下降，但此時反應(yīng)體系中5-HMF和丙烯酰胺的含量較高。因此，將反應(yīng)溫度和時間分別控制在60 ℃和12 h以內(nèi)，可有效減少糖基化體系中AGEs的生成，進(jìn)而提高食品的安全性。

圖6 反應(yīng)時間(A)和反應(yīng)溫度(B)對BSA-葡萄糖體系中的熒光性AGEs生成的影響Fig.6 Effect of reaction time (A) and temperature (B) on the formation of fluorescent AGEs in BSA-glucose system

2.7 類黑精含量變化

類黑精是指MR后期生成的一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的棕褐色高分子化合物，具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌、降糖和降血壓等生理功能[30]。由圖7可知，BSA-葡萄糖樣品中的類黑精含量隨著反應(yīng)時間的延長和反應(yīng)溫度的升高均呈現(xiàn)出先增加后下降的趨勢(P<0.05)。反應(yīng)時間和溫度在12 h和60 ℃之內(nèi)，糖基化體系中的類黑精含量增加緩慢，當(dāng)反應(yīng)時間和溫度分別超過12 h和60 ℃時，其含量大幅度增加，分別在48 h(0.14 mmol/L)和80 ℃(0.10 mmol/L)達(dá)到最大值。這是因?yàn)轭惡诰纳闪颗c丙烯酰胺含量具有顯著的相關(guān)性[31]，由圖5可知，糖基化體系中丙烯酰胺的含量在反應(yīng)時間48 h和反應(yīng)溫度80 ℃時分別達(dá)到最高值。但當(dāng)反應(yīng)時間超過48 h，反應(yīng)溫度超過80 ℃時，類黑精含量顯著下降，這可能是因?yàn)樾纬傻牟糠执蠓肿宇惡诰y溶于水，也有可能是溫度過高或者長時間處理樣品使部分類黑精發(fā)生裂解所致[16]。

圖7 反應(yīng)時間(A)和反應(yīng)溫度(B)對BSA-葡萄糖體系中類黑精含量的影響Fig.7 Effect of reaction time (A) and temperature (B) on the content of melanoidin of BSA-glucose system

3 結(jié)論

針對食品熱加工過程中會形成有害糖基化產(chǎn)物的現(xiàn)狀，本文旨在研究反應(yīng)時間和反應(yīng)溫度的變化對糖基化產(chǎn)物形成的影響。結(jié)果表明，反應(yīng)溫度為55 ℃時，糖基化體系中的果糖胺、羰基、AGEs和類黑精含量隨反應(yīng)時間的延長呈先增加后下降的趨勢，但5-HMF和丙烯酰胺含量逐漸增加；反應(yīng)時間為12 h時，糖基化體系中的果糖胺、羰基、5-HMF、AGEs和類黑精含量隨反應(yīng)溫度的升高呈先增加后下降的趨勢，但丙烯酰胺含量逐漸增加。反應(yīng)時間和反應(yīng)溫度分別超過12 h和60 ℃時，體系中的果糖胺、羰基、5-HMF、丙烯酰胺、AGEs和類黑精含量大幅度增加。因此，將反應(yīng)溫度控制在60 ℃以內(nèi)，反應(yīng)時間不超過12 h時，能有效減少BSA-葡萄糖體系中有害糖基化產(chǎn)物的產(chǎn)生，本研究結(jié)果可為高蛋白、高糖類食品在熱加工過程中有害糖基化產(chǎn)物形成的調(diào)控提供一定的科學(xué)依據(jù)。