張佳敏，王衛(wèi)，吉莉莉，白婷，陳林，劉達(dá)玉

(成都大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院，四川 成都，610106)

中國(guó)的羊肉制品歷史悠久，包括腌臘、醬鹵、燒烤等多個(gè)類型近百種產(chǎn)品，其中風(fēng)羊腿是最有代表性的傳統(tǒng)腌臘肉制品之一，產(chǎn)品以羊腿為原料，經(jīng)修整、上鹽、腌制、自然風(fēng)干、貯藏成熟等工序加工而成，加工期在30 d以上[1-3]。對(duì)中國(guó)傳統(tǒng)腌臘肉制品的研究表明，在自然風(fēng)干及貯藏過程中，肉品原料會(huì)發(fā)生一系列有利于風(fēng)味形成的理化及微生物變化，尤其是在風(fēng)干環(huán)節(jié)，隨著水分的降低，還伴隨著脂肪和蛋白質(zhì)的分解、氧化等反應(yīng)，逐漸產(chǎn)生醛、酮、酸等一系列小分子化合物，從而形成產(chǎn)品獨(dú)有的風(fēng)味特征[4-5]。對(duì)發(fā)酵肉制品的研究顯示，在發(fā)酵過程中微球菌和非致病性葡萄球菌中含有豐富的蛋白酶和脂肪酶，可將蛋白質(zhì)和脂肪分解為氨基酸和脂肪酸，對(duì)產(chǎn)品風(fēng)味形成產(chǎn)生重要影響，即使是在中式腌臘肉制品中，這一基于微生物的風(fēng)味形成途徑對(duì)于緩慢風(fēng)干的產(chǎn)品也不可或缺[6-7]。目前已有關(guān)于利用微生物發(fā)酵劑的方式提升中國(guó)傳統(tǒng)腌臘制品風(fēng)味和品質(zhì)，縮短發(fā)酵期，實(shí)現(xiàn)安全性可控的研究報(bào)道，如劉曉強(qiáng)等[8]利用篩選出的戊糖片球菌、變異微球菌、木糖葡萄球菌和乳酸菌用于火腿，以改善風(fēng)味，降低亞硝酸鹽殘留；蔣云升等[9]采用微生物發(fā)酵制作兔肉發(fā)酵制品以提升產(chǎn)品中游離氨基酸含量；王衛(wèi)等接種促進(jìn)風(fēng)味形成為主導(dǎo)的發(fā)酵微生物，如肉色葡萄球菌、木糖葡萄球菌等的復(fù)合菌種，加工出符合中式消費(fèi)習(xí)慣的臘腸和臘肉等肉制品，顯著提升產(chǎn)品風(fēng)味[10]，對(duì)風(fēng)羊腿中微生物的特征及其風(fēng)味特性目前尚缺少系統(tǒng)研究。

Biolog-ECO微生物分析系統(tǒng)是一種通過監(jiān)測(cè)微生物對(duì)不同碳源底物利用程度，用以描述微生物群落特征的快速、簡(jiǎn)便的方法，由于Biolog分析法可實(shí)現(xiàn)大范圍、快速、自動(dòng)化和標(biāo)準(zhǔn)化的微生物檢測(cè)，已被廣泛應(yīng)用于土壤、水質(zhì)中微生物群落分析[11-13]，以及環(huán)境修復(fù)效果評(píng)價(jià)等方面，但其應(yīng)用范圍還較窄[14-15]，特別是在食品領(lǐng)域應(yīng)用很少，目前在中式發(fā)酵食品中的應(yīng)用主要為探究泡菜和酒曲中微生物多樣性[16-17]。本研究將其應(yīng)用于腌臘肉制品，以自然風(fēng)干法和添加微生物發(fā)酵劑風(fēng)干法加工風(fēng)羊腿，采用Biolog-ECO微生物分析系統(tǒng)對(duì)產(chǎn)品中微生物群落的代謝特征以及多樣性特征進(jìn)行分析，并結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS)進(jìn)一步對(duì)產(chǎn)品中揮發(fā)性風(fēng)味物進(jìn)行檢測(cè)，探究微生物調(diào)控對(duì)產(chǎn)品微生物群落和風(fēng)味特性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮帶皮羊腿：四川北牧南江黃羊集團(tuán)有限公司；SM-194凍干菌，復(fù)合菌種為肉葡萄球菌、木糖葡萄球菌、戊糖片球菌、清酒乳桿菌和漢遜德巴利酵母菌(Staphylococcuscarnosus，Staphylococcusxylosus，Pediococcuspentosaceus，Lactobacillussakei，Debaromyceshansenii)，德國(guó)Chr. Hansen公司。

電子天平(TJA3130N)，上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；水浴鍋(DZKW-4)，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；微生物鑒定系統(tǒng)Biolog-ECO，MicroStation；氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)安捷倫；拍打式勻漿機(jī)(XY-05)，寧波新藝超聲設(shè)備有限公司；微量加樣器(100-1000)，瑞士索科；生化培養(yǎng)箱(LRH-250)，上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 風(fēng)羊腿制作

(1)產(chǎn)品配方

傳統(tǒng)自然風(fēng)干組(A組)：以整只羊后腿為原料，每1 000 g肉料添加食鹽70 g、亞硝酸鈉0.1 g、D-異抗壞血酸鈉0.8 g、葡萄糖5.0 g、八角2 g、花椒4 g。

添加微生物發(fā)酵菌組(B組)：添加SM-194凍干菌，其他與A組相同。

(2)制作工藝

修整→上鹽→入缸腌制(4 ℃，12 d，其間上下翻動(dòng)3～4次)→清洗晾掛→自然風(fēng)干(至脫水15%)→修割整形→發(fā)酵風(fēng)干(8～12 ℃，相對(duì)濕度50%～65%，18 d，至失重30%～32%)→切段、真空包裝→貯藏、后發(fā)酵(6～8 ℃，30 d)→成品

1.3 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.3.1 基于Biolog-ECO法的微生物特性分析

在Biolog-ECO平板上有96個(gè)微孔，包含3組相同的碳源配置，每組包含1個(gè)空白對(duì)照和31份不同類型的單一碳源以及相同含量的四唑紫染料(tetrazolium violet, TV)。微生物在利用碳源過程中產(chǎn)生的自由電子與染料發(fā)生還原顯色反應(yīng)，利用顏色反映的濁度差反映微生物對(duì)碳源的利用程度[18]。

在風(fēng)羊腿中段深入表皮1 cm下取樣，將肉樣剪碎后，加入生理鹽水(0.9 %的NaCl)225 mL，用拍打式均質(zhì)機(jī)均質(zhì)5 min后取1 mL均質(zhì)液，用生理鹽水稀釋100倍后，取稀釋的懸濁液加入Biolog-ECO平板，每孔為15 μL。將平板置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔24 h用酶標(biāo)儀測(cè)定96個(gè)孔在590 nm和750 nm下的吸光度[18-19]。微生物對(duì)碳源的代謝強(qiáng)度用平均吸光度(average well color development，AWCD)表示，計(jì)算公式為：

(1)

式中：A590,反應(yīng)孔590nm時(shí)的吸光度；A750,反應(yīng)孔750nm時(shí)的吸光度。

微生物對(duì)各類碳源的代謝強(qiáng)度采用吸光度分率表示[20]，其定義式為：

(2)

(3)

式中：Pi,第i種碳源的吸光度分率；Pj,第j類碳源的平均吸光度分率；nj,第j類碳源的數(shù)目。

采用豐富度指數(shù)(S)來評(píng)估微生物物種的豐富度，即被微生物利用的碳源總數(shù)，為每孔中(A590～A750)的值大于0.25的孔個(gè)數(shù)[21]；采用Shannon-Wiener指數(shù)(H′)來表示系統(tǒng)中微生物的功能多樣性，H′值定義見公式(4)[18]；采用均勻度指數(shù)(E)來表示群落實(shí)測(cè)多樣性與最大多樣性的比率，E值定義見公式(5)[19]；采用Simpson指數(shù)(D)來說明最常見種的優(yōu)勢(shì)度，D值定義見公式(6)[19,21]。

H′=-∑Pi·lnPi

(4)

E=H′/Hmax=H′/lnS

(5)

(6)

1.3.2 揮發(fā)性風(fēng)味成分測(cè)定

參考TABANELLI等[22]的方法，并稍作修改。在風(fēng)羊腿中段深入表皮1 cm下取樣，將肉樣剪碎后，準(zhǔn)確稱取3.0 g粉粹均勻的樣品，放入15 mL頂空瓶中密封，采用動(dòng)態(tài)頂空制樣。GC-MS分析圖譜經(jīng)計(jì)算機(jī)和人工把每個(gè)峰同時(shí)與NIST library和Wiley Library相匹配檢索定性，匹配度和純度大于800(最大值1 000)作為定性分析結(jié)果。對(duì)化合物進(jìn)行定量分析時(shí)，對(duì)總離子流量色譜圖用峰面積歸一化法定量，得出各組分的相對(duì)含量。

固相微萃取條件：固相微萃取頭CAR/PDMS 75 μm(美國(guó)SUPELCO公司)；萃取溫度：80 ℃；萃取時(shí)間：40 min；解吸時(shí)間：3 min；儀器條件：HP 6890/5973 GC/MS(美國(guó)安捷倫科技有限公司)；色譜柱：HP-INNOWAX(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；分流比：2∶1；升溫程序：起始溫度50 ℃，保持3 min，以每分鐘5 ℃升至150 ℃，再以每分鐘10 ℃升至260 ℃；離子源：EI；電離能量：70 EV；離子源溫度：230 ℃；四極桿溫度：150 ℃；質(zhì)量掃描范圍：20～450 amu。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物代謝活性分析

基于Biolog-ECO法的微生物特性分析結(jié)果，傳統(tǒng)自然風(fēng)干組(A組)和添加微生物發(fā)酵劑組(B組)的AWCD變化曲線如圖1所示。AWCD曲線的變化速率反映了微生物的平均代謝活性，AWCD值增加越快，表明微生物的平均代謝活性越高[15]。由圖1可見，2組產(chǎn)品的AWCD曲線大致都包含了停滯期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和穩(wěn)定期3個(gè)階段，總體變化趨勢(shì)為前24 h微生物活性低，24～48 h開始升高，48～72 h趨于平緩，72 h后顯著升高，144 h后進(jìn)入平穩(wěn)階段。對(duì)比2組風(fēng)羊腿的微生物活性強(qiáng)弱可看出，B組的AWCD值在前72 h低于A組，但72 h后B組的AWCD值顯著升高，微生物代謝活性大大高于A組。在發(fā)酵初期代謝活性不及自然風(fēng)干組，而在培養(yǎng)72 h后，B組的菌群代謝活性大大提高，因而AWCD曲線增長(zhǎng)明顯加快，且顯著高于A組，在144～168 h的平穩(wěn)階段，B組的代謝活性約為A組的1.7倍。由此可見，所添加的微生物發(fā)酵菌在經(jīng)過適應(yīng)期后，其代謝活性大大高于原生菌群，菌種的作用效果需經(jīng)較長(zhǎng)時(shí)間的發(fā)酵方可顯現(xiàn)。

圖1 風(fēng)羊腿AWCD變化曲線Fig.1 Change of AWCD value of goat ham

2.2 微生物特征分析

Biolog-ECO平板碳源分為聚合物類、氨基酸類、酯類、醇類、胺類、酸類6大類，微生物對(duì)各類碳源的代謝能力采用吸光度分率表示，用以分析微生物對(duì)不同種類碳源的代謝特性[21]。分析得到2組產(chǎn)品微生物對(duì)6類碳源代謝能力的平均吸光度分率如圖2所示。

圖2 兩組風(fēng)羊腿微生物對(duì)6類碳源的利用特征Fig.2 Changes in AWCD for six substrate categories of two groups of goat ham

由圖2可見，各類碳源的平均吸光度分率均隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，B組對(duì)6類碳源的利用強(qiáng)度整體較高，尤其是對(duì)醇類和酸類物質(zhì)的代謝強(qiáng)度，在整個(gè)培養(yǎng)期內(nèi)都高于A組。而其他幾類碳源的代謝情況是在培養(yǎng)96～120 h后方才表現(xiàn)為B組高于A組。

2.3 微生物多樣性分析

單一系統(tǒng)中微生物群落特性可以用Shannon-Wiener指數(shù)(H′)、均勻度指數(shù)(E)以及Simpson指數(shù)(D)等來表征，用以反映微生物群落功能多樣性的不同側(cè)面[18,20]。豐富度指數(shù)S為群落中總的物種數(shù)，Shannon-Wiener指數(shù)H′是反映豐富度和均勻度的綜合指標(biāo)，其包含著2個(gè)成分：種數(shù)(species)和各種間個(gè)體分配的均勻性(evenness)，種數(shù)越多，各種之間個(gè)體分配越均勻，H′值就越大[23]。以2組樣品微生物代謝強(qiáng)度曲線達(dá)到快速增長(zhǎng)期，即96 h時(shí)的AWCD進(jìn)行比較分析，結(jié)果如表1所示。

表1 兩組風(fēng)羊腿微生物群落多樣性指數(shù)Table 1 Diversity indices of microorganism communitiesin two groups of goat ham

2組產(chǎn)品的差異主要體現(xiàn)在豐富度指數(shù)S和多樣性指數(shù)H′上，B組的豐富度指數(shù)S和多樣性指數(shù)H′均高于自然風(fēng)干組，說明2組產(chǎn)品在多樣性上的差異主要是由物種數(shù)量上的差異造成的，B組產(chǎn)品由于添加了微生物發(fā)酵劑，且添加的菌種在后期貯藏過程中較好地適應(yīng)了產(chǎn)品內(nèi)環(huán)境，顯示出較強(qiáng)的代謝活性，從而增加了樣品中微生物的豐富度和多樣性，而2組產(chǎn)品的菌群在均勻度指數(shù)E和Simpson指數(shù)D差異不大。

2.4 揮發(fā)性風(fēng)味成分分析

采用GC-MS分析法對(duì)2組羊腿中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測(cè)定結(jié)果見圖3和表2，2組產(chǎn)品風(fēng)味物種類對(duì)比見圖4。

圖3 風(fēng)羊腿揮發(fā)性風(fēng)味成分總離子流圖Fig.3 The TIC of volatile flavor components of goat ham

就風(fēng)味物相對(duì)含量比較，A組含量最高的為醇類(34.433%)和酸類(28.225%)，其次分別為醛類(8.392%)、酮類(6.405%)、烯烴類(4.733%)、酚類(2.476%)、酯類物質(zhì)未檢出(0.000%)；B組含量最高的為醇類(39.179%)和醛類(23.779%)，其次分別為酸類(16.144%)、烯烴類(7.980%)、酯類(4.685%)、酮類(5.892%)、酚類(0.230%)。而從生成的風(fēng)味物種類分析，A組依次為：酸類(8種)>醇類(5種)>醛類(4種)>烯烴類(3種)=酚類(3種)>酮類(2種)>酯類(0種)；B組依次為：醛類(13種)>醇類(8種)=酸類(8種)>酯類(5種)>酮類(3種)>烯烴類(2種)=酚類(2種)。A組共檢出25種，B組共檢出41種，結(jié)合微生物代謝特征和多樣性檢測(cè)分析結(jié)果，添加發(fā)酵劑的產(chǎn)品中揮發(fā)性風(fēng)味成分的種類極顯著多于傳統(tǒng)風(fēng)干組，顯然與其菌群具有較高的微生物代謝活性有密切關(guān)聯(lián)，微生物發(fā)酵劑對(duì)風(fēng)羊腿風(fēng)味物質(zhì)形成具有促進(jìn)作用，這與王衛(wèi)等[10]在微生物發(fā)酵劑對(duì)四川臘腸和臘肉風(fēng)味影響的研究中的結(jié)果相符。

表2 風(fēng)羊腿揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)比較Table 2 Comparison of volatile flavor of goat ham

續(xù)表2

種類化合物名稱相對(duì)百分含量/%A組B組醛類2-Undecenal 2-十一碳烯醛-0.551Benzaldehyde,4-(1-Methylethyl) 4-異丙基苯甲醛-0.525Pentadecanal 十五醛0.688-Hexadecanal 十六醛-0.14總量8.392(4種)23.779(13種)酮類2-Butanone,3-hydroxy 3-羥基-2-丁酮2.7013.5422-Cyclohexen-1-one,3-methyl-6-(1-methylethyl)2-羥基-6-甲基-3-(1-甲乙基)-2-環(huán)己烯-1-酮3.704-2,3-Octanedione 2,3-二酮-2.0613,5-Octadiene-2-one 3,5-二烯酮-0.289總量6.405(2種)5.892(3種)酸類Acetic acid 乙酸22.8169.973Butanoic acid 丁烷酸2.1320.22Pentanoic acid 戊酸0.12-Hexanoic acid 己酸-0.878heptanoic acid 庚酸1.902-Caprylic acid 辛酸0.8450.15Nonanoic acid 壬酸0.162.543Decanoic acid 癸酸0.132.032-Decenal,(Z) 順,2-癸酸-0.21dodecanoic acid 十二酸0.12-Hexadecanoic acid 十六酸-0.14總量28.225(8種)16.144(8種)酚類Phenol 苯酚0.110.125Phenol,3-methy 3-甲基-苯酚-0.105Phenol,4-methyl 4-甲基-苯酚0.15-Eugenol 丁香油酚2.216-總量2.476(3種)0.230(2種)酯類Ethyl Caprylate 辛酸乙酯-2.5323-Cyclohexen-1-ol,4-methyl-1-(1-methylethyl)2-甲基-丙酸-1-甲基-1-(4-甲基-3-環(huán)己烯-1-基)乙酯-0.14Ethyl Caprate 癸酸乙酯-1.748Tetradecanoic acid,ethyl ester 肉豆蔻酸乙酯-0.155Hexadecanoic,ethyl ester 棕櫚酸乙酯-0.11總量0(0種)4.685(5種)總風(fēng)味物種類數(shù)25種41種

注：“-”表示未檢測(cè)出。

對(duì)產(chǎn)品中各類風(fēng)味成分進(jìn)行分類分析比較，醇類物質(zhì)在A組中檢測(cè)到5種，在B組中檢測(cè)到8種，2組中均檢測(cè)到的物質(zhì)為乙醇、正戊醇、沉香醇、α,松油醇和苯甲醇；添加了發(fā)酵劑的B組產(chǎn)品α，松油醇和苯甲醇含量較A組有所提升，此外還檢測(cè)出了1-己醇、2-辛烯-1-醇和正辛醇。醇類物質(zhì)中的不飽和醇閾值較低，對(duì)風(fēng)味的形成產(chǎn)生一定貢獻(xiàn)[25]。

醛類化合物主要來自于脂肪氧化和降解[24]。醛的閾值一般很低，具有脂肪香味，是肉香味的主要成分[25]。A組產(chǎn)品中檢測(cè)出了4種醛類化合物，總量為8.392%，其中主要為壬醛，含量為7.234%；B組產(chǎn)品中檢測(cè)出了13種醛類化合物，總量為23.779%，與A組相比，醛類化合物的種類和含量均得到提升，其中己醛是亞油酸的主要氧化產(chǎn)物，苯甲醛是苯丙氨酸的降解產(chǎn)物[26]，它們對(duì)整體風(fēng)味的形成起著重要作用，說明微生物對(duì)提升醛類化合物含量具有較強(qiáng)的促進(jìn)作用。

酸類物質(zhì)在2組產(chǎn)品中均檢測(cè)出8種，總量分別為28.225%和16.144%，主要為乙酸，但B組乙酸含量與A組相比大大降低，結(jié)合微生物對(duì)碳源的利用情況分析，可能與微生物對(duì)酸類底物的利用強(qiáng)度較高有關(guān)。酯類物質(zhì)在A組中未檢出，在B組中檢出5種，以辛酸乙酯和癸酸乙酯為主，具有果香和酒香香氣，對(duì)風(fēng)味有促進(jìn)作用。對(duì)比可見，添加了微生物發(fā)酵劑的B組產(chǎn)品酸類物質(zhì)有所降低，而酯類物質(zhì)含量得到提升。烯烴類化合物及酚類化合物2組產(chǎn)品之間差異不大。

圖4 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類Fig.4 Varieties of volatile flavor compounds

3 結(jié)語

采用基于Biolog-ECO微生物分析系統(tǒng)的微生物特征分析，以及GC-MS對(duì)揮發(fā)性風(fēng)味物的檢測(cè)，比較了添加或不添加微生物發(fā)酵劑對(duì)自然風(fēng)干發(fā)酵的風(fēng)羊腿微生物特性和風(fēng)味的影響。結(jié)果表明，SM-194微生物發(fā)酵劑對(duì)風(fēng)羊腿的AWCD值產(chǎn)生顯著影響，盡管在發(fā)酵初期添加發(fā)酵劑的產(chǎn)品微生物代謝活性略低，但隨發(fā)酵風(fēng)干期的延長(zhǎng)顯著升高，且對(duì)6類碳源的利用強(qiáng)度也整體高于對(duì)照組的原生菌群，對(duì)風(fēng)羊腿中底物的分解能力更強(qiáng)，尤其對(duì)促進(jìn)酯類物質(zhì)的形成效果更佳。

微生物多樣性分析表明，添加微生物發(fā)酵劑組的多樣性指數(shù)H’和豐富度指數(shù)S均高于對(duì)照組，而均勻度指數(shù)E和優(yōu)勢(shì)度指數(shù)D差異不明顯。進(jìn)一步的風(fēng)味物種類和含量檢測(cè)結(jié)果顯示，添加微生物發(fā)酵劑后，風(fēng)羊腿的風(fēng)味物種類達(dá)到41種，而未添加組僅為25種，尤其是在醇類、醛類及酯類物質(zhì)的種類和含量上，添加微生物發(fā)酵劑組均更為豐富，其中，醇類物質(zhì)增加了3種，醛類物質(zhì)增加了9種，酯類物質(zhì)檢測(cè)出5種，而未添加發(fā)酵劑的產(chǎn)品未檢出酯類物質(zhì)。

傳統(tǒng)自然風(fēng)干腌臘肉制品在工藝和產(chǎn)品特性上可歸結(jié)為發(fā)酵肉制品類型，風(fēng)干發(fā)酵進(jìn)程中微生物的參與，尤其是微生物種類和含量對(duì)產(chǎn)品的特有風(fēng)味的形成具有重要的作用。結(jié)果表明，微生物發(fā)酵劑對(duì)自然風(fēng)干腌臘肉制品微生物多樣性的提升，顯然有益于產(chǎn)品風(fēng)味物成分的形成。而且隨著發(fā)酵貯藏期的延長(zhǎng)SM-194微生物發(fā)酵菌所顯現(xiàn)的作用才會(huì)更加顯著。