宋婷婷，吳珍珍，宗紅，陸信曜，諸葛斌*

1(糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點實驗室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122) 2(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122) 3(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，工業(yè)微生物研究中心，江蘇 無錫，214122)

米曲霉(Aspergillusoryzae)具有強大的蛋白分泌能力和公認(rèn)的食品安全性，是傳統(tǒng)豆醬、醬油等釀造工業(yè)的重要菌株[1]，其分泌的蛋白酶能夠?qū)⒌鞍踪|(zhì)水解成多肽及氨基酸，增強釀造食品的味道和風(fēng)味[2-3]。由于長期受到高蛋白環(huán)境的馴化，米曲霉產(chǎn)生的蛋白酶對植物蛋白有較高的水解能力，同時可有效減輕大豆蛋白水解產(chǎn)物的苦味[4-5]。2005年，日本科學(xué)家完成了米曲霉RIB40全基因組序列的測序[6-7]，為深刻理解米曲霉的遺傳背景和生產(chǎn)性能、快速挖掘其作為工業(yè)生產(chǎn)菌株的潛能提供了豐富可靠的遺傳信息。

蛋白質(zhì)水解液的苦味是由多肽鏈末端的疏水性氨基酸引起的[8]，氨肽酶作為蛋白酶中肽鏈外切酶的一種，可以從蛋白質(zhì)或多肽鏈的N端水解氨基酸，使氨基酸呈游離狀態(tài)，從而達(dá)到脫苦的目的[9-10]。目前已有多種細(xì)菌和真菌來源的氨肽酶被分離純化或者異源表達(dá)，并被用于脫苦蛋白質(zhì)水解液。黃偉謙等在畢赤酵母GS115中表達(dá)了來自醬油曲霉的亮氨酸氨肽酶，將其應(yīng)用于大豆蛋白及酪蛋白酶解液中的苦味肽，發(fā)現(xiàn)苦味肽的苦味值分別下降了59.62%及64.18%，且游離氨基酸含量顯著提高[11]；雷芬芬等將從海洋地衣芽孢桿菌SWJS33中分離純化出的氨肽酶與木瓜蛋白的堿性蛋白酶水解液作用，脫苦效果十分顯著[12]；而天冬酰胺氨肽酶可以從N端水解釋放谷氨酸和天冬氨酸，而這兩種氨基酸是鮮味氨基酸，具有低閾值的苦味，可以降低蛋白質(zhì)水解液的苦味[13-15]。

本研究前期通過生物信息預(yù)測，挖掘出4個米曲霉疑似短肽酶的基因，其中只有天冬酰胺氨肽酶具有功能，并將新基因克隆到畢赤酵母中進(jìn)行分泌表達(dá)，對其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，并應(yīng)用于大豆多肽水解液中，進(jìn)一步探討該酶在食品脫苦中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及質(zhì)粒

米曲霉CGMCC No.7586、大腸桿菌JM109、畢赤酵母GS115、質(zhì)粒pPIC9K均保藏于本研究室。

1.1.2 主要試劑

限制性核酸內(nèi)切酶、ExTaqDNA聚合酶及T4DNA連接酶,寶生物工程(大連)有限公司(Takara)；Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒,康為世紀(jì)科技有限公司；遺傳霉素(G418)、酵母無氨基氮源(yeast nitrogen base，YNB),上海寶賽生物科技有限公司；多肽底物由常州康龍生物科技有限公司合成；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

PDA(g/L)：蔗糖20，馬鈴薯200，瓊脂粉20；

LB(g/L)：酵母粉5，蛋白胨10，氯化鈉10，固體培養(yǎng)基中添加20瓊脂粉；

YPD(g/L)：酵母粉10，蛋白胨20，葡萄糖20，固體培養(yǎng)基中添加20瓊脂粉；

脫脂牛奶培養(yǎng)基(g/L)：YNB 13.4，生物素0.4 mg/L，甲醇體積分?jǐn)?shù)為1%，脫脂奶粉20，瓊脂粉20。

MD(g/L)：YNB 13.4，葡萄糖20，生物素0.4 mg/L，瓊脂粉20；

BMGY(g/L)：酵母粉10，蛋白胨20，甘油10，YNB 13.4，生物素0.4 mg/L，0.1 mmol/L pH值為6.0磷酸鉀緩沖液；

BMMY(g/L)：酵母粉10，蛋白胨20，YNB 13.4，生物素0.4 mg/L，0.1 mmol/L pH值為6.0磷酸鉀緩沖液，甲醇體積分?jǐn)?shù)1%；

YPD-G418：在YPD中添加終質(zhì)量濃度分別為1、2、3、4 mg/mL的G418，用于陽性轉(zhuǎn)化子拷貝數(shù)的篩選。

1.1.4 引物的設(shè)計

根據(jù)GeneBank中公布的米曲霉RIB40的AAP基因序列設(shè)計引物，引物設(shè)計見表1。其中，上游引物F引入EcoRⅠ酶切位點，下游引物R引入NotⅠ酶切位點和6×His標(biāo)簽。

表1 本研究中使用的引物Table 1 Primers used in this study

1.2 方法

1.2.1 米曲霉AAP的生物信息學(xué)分析

利用NCBI-Blast、SWISS-MODEL、SignalP4.1等生物信息學(xué)分析工具，對米曲霉AAP的基本理化性質(zhì)、序列特征、結(jié)構(gòu)域、二級結(jié)構(gòu)及三級結(jié)構(gòu)等進(jìn)行分析和預(yù)測。

1.2.2 目的基因的克隆及重組表達(dá)載體的構(gòu)建

米曲霉RNA的提取及cDNA的合成按照試劑盒說明書進(jìn)行。以米曲霉cDNA為模板，PCR擴增獲得目的基因片段。將目的基因片段和質(zhì)粒pPIC9K分別用EcoRⅠ和NotⅠ進(jìn)行酶切，純化回收后，用T4DNA連接酶將目的基因與載體連接，16 ℃保溫過夜，轉(zhuǎn)化至EscherichiacoliJM109感受態(tài)細(xì)胞中，將轉(zhuǎn)化后的菌液涂布于含有Amp的LB固體平板中，37 ℃培養(yǎng)12 h。提取菌落PCR驗證為陽性菌株的質(zhì)粒，分別進(jìn)行雙酶切及測序驗證。

1.2.3 重組畢赤酵母的構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá)

將重組質(zhì)粒用SacⅠ線性化，純化回收后電擊轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞中，將轉(zhuǎn)化后的菌液涂布于MD平板上，30 ℃培養(yǎng)2～3 d。挑取MD平板上長出的單菌落至YPD-G418梯度抗性平板上，在含質(zhì)量濃度為4 mg/mL G418 YPD平板上挑取5個單菌落進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。

種子培養(yǎng)：將單菌落接種于YPD培養(yǎng)基中，30 ℃，200 r/min條件下培養(yǎng)18～20 h。

發(fā)酵培養(yǎng)：按1%的接種量接種至裝有50 mL BMGY培養(yǎng)液的500 mL三角瓶中，30 ℃，200 r/min條件下培養(yǎng)24 h，收集發(fā)酵液并離心，將菌體轉(zhuǎn)移至BMMY培養(yǎng)基中，按體積分?jǐn)?shù)為1%的甲醇添加量，在30 ℃，200 r/min條件下誘導(dǎo)產(chǎn)酶。此后每隔24 h添加體積分?jǐn)?shù)為1%的甲醇，同時取樣測酶活并進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳及平板鑒定。

1.2.4 重組AAP的純化

收集發(fā)酵液，離心取上清，即為粗酶液。用His Trap HP親和色譜柱對粗酶液進(jìn)行純化，將純化后的酶液于4 ℃保存?zhèn)溆?。其中，純化緩沖液A為0.5 mol/L NaCl，0.02 mol/L Na2PO4，0.02 mol/L咪唑，pH值為7.4；緩沖液B為0.5 mol/L NaCl，0.02 mol/L Na2PO4，0.5 mol/L咪唑，pH值為7.4。

1.2.5 重組AAP酶活的測定

將20 μL酶液和160 μL pH值為8.0的Tris-HCl緩沖液混勻，50 ℃預(yù)熱2 min，再加入20 μL 10 mmol/L的Asp-pNA溶液，50 ℃水浴反應(yīng)10 min。反應(yīng)結(jié)束后立即加入200 μL體積分?jǐn)?shù)為40%的乙酸終止反應(yīng)，在405 nm處測定吸光值。

酶活的定義：在一定pH值，50 ℃條件下，每分鐘水解Asp-pNA生成1 μgpNA所用的酶量為1個酶活力單位(U/mL)。

(1)

式中，U表示酶活，U/mL；n表示酶液的稀釋倍數(shù)；20表示反應(yīng)總體系對酶液的稀釋倍數(shù)；138.12表示pNA的相對分子質(zhì)量；A表示根據(jù)酶活反應(yīng)測得的A405 nm的值，查標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的pNA的濃度，mmol/L；10表示反應(yīng)時間，min。

1.2.6 重組AAP的酶學(xué)性質(zhì)研究

(1)最適pH及pH穩(wěn)定性：在pH 3.0～10.0(pH 3.0～8.0 20 mmol/L檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，pH 8.0～10.0 20 mmol/L Tris-HCl緩沖液)條件下測定酶活，最高酶活值為100%；將酶分別在pH 3.0～10.0條件下40 ℃保溫1 h后檢測蛋白酶的pH穩(wěn)定性。

(2)最適溫度及溫度穩(wěn)定性：在不同溫度(30～70 ℃)條件下測定酶活，最高酶活值為100%；將酶分別在40～70 ℃條件下保溫30、60、90、120 min后檢測蛋白酶的溫度穩(wěn)定性。

(3)金屬離子及抑制劑對重組AAP活性的影響：向反應(yīng)體系中加入終濃度為10 mmol/L的金屬離子(Fe2+、Ca2+、Zn2+、Be2+、Mg2+、Mn2+、K+)，測定酶活，未加入金屬離子的酶活值為100%；向反應(yīng)體系中加入終濃度為1 mmol/L的碘乙酰胺(iodoacetamide，IAM)、乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)、苯甲基碘酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)、胃蛋白酶抑制劑(pepstain)，測定酶活。未加入抑制劑的酶活值為100%。

(4)底物特異性及動力學(xué)參數(shù)的測定：向反應(yīng)體系中加入不同的底物(Asp-pNA、Pro-pNA、Asn-pNA、Glu-pNA、Tyr-pNA、Leu-pNA)，測定酶活，最高酶活值為100%；向反應(yīng)體系中加入不同的Asp-pNA濃度(0.2～10 mmol/L)，測定酶活，采用Lineweaver-BurK法作圖，計算其Km及Vmax。

1.2.7 重組AAP對大豆多肽的水解

用50 mmol/L pH值為7.0的磷酸緩沖液配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的大豆蛋白，沸水浴中熱處理15 min后冷卻至室溫，按酶與底物比(E/S)為5 000 U/g加入堿性蛋白酶，在其最適反應(yīng)條件(pH值為10.0，溫度50 ℃)下保溫6 h，反應(yīng)期間用0.1 mol/L的NaOH維持反應(yīng)體系的pH。反應(yīng)結(jié)束后沸水浴10 min使酶滅活，離心取上清，即得到大豆多肽溶液，于-20 ℃保存?zhèn)溆?。以E/S分別為1 000、4 000、8 000 U/g向大豆多肽溶液中加入重組蛋白酶，在其最適反應(yīng)條件(pH值為7.0，溫度50 ℃)下按照同樣的方法進(jìn)行酶解。采用OPA(鄰苯二甲醛)法測定水解液的水解度[13]，并以不同濃度的咖啡因作為標(biāo)準(zhǔn)對苦味進(jìn)行感官評定[11, 16-17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 米曲霉AAP基因的克隆及生物信息學(xué)分析

根據(jù)GeneBank中公布的米曲霉RIB40的AAP基因序列設(shè)計引物，以提取的米曲霉RNA為模板合成cDNA，以cDNA為模板，PCR擴增獲得目的基因片段，電泳結(jié)果如圖1所示，獲得1條約1.5 kbp左右的條帶，與目的基因大小相符。由測序結(jié)果及Blast序列比對得知，該基因序列與米曲酶RIB40的AAP基因序列同源，氨基酸序列相似性達(dá)99.7%。

M-DL2503 Marker；1-AAP基因PCR產(chǎn)物圖1 AAP基因PCR結(jié)果電泳圖Fig.1 Electrophoretogram of AAP gene

對該基因進(jìn)行基本理化性質(zhì)預(yù)測，發(fā)現(xiàn)其存在信號肽序列，信號肽剪切位點位于第22～23位氨基酸之間，該基因編碼498個氨基酸，其編碼的蛋白質(zhì)理論分子質(zhì)量為53.9 kDa，等電點為5.94，存在糖基化及磷酸化位點，二級結(jié)構(gòu)中含有33.94%的α-螺旋，5.62%的β-折疊，16.87%的延伸連，43.57%的無規(guī)則卷曲。結(jié)構(gòu)域預(yù)測發(fā)現(xiàn)該基因編碼的蛋白質(zhì)屬于氨肽酶M18家族，特異性切割末端氨基酸殘基為酸性氨基酸的肽鍵。其活性位點具有2個催化Zn2+，由His91、Asp274、Glu312、Asp363、His463結(jié)合，其中Asp274連接2個Zn2+。以人天冬酰胺氨肽酶(human aspartly aminopeptidase，DNPEP)為模板進(jìn)行同源建模，結(jié)果如圖2所示。

圖2 三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.2 Prediction of the 3D structure

將該基因編碼的氨基酸序列與GenBank中收錄的來源于人、牛、酵母的天冬酰胺氨肽酶氨基酸序列進(jìn)行同源性序列比對，一致性分別達(dá)到49%、51%、53%，比對結(jié)果如圖3所示。據(jù)報道，來源于人的天冬酰胺氨肽酶有類似的結(jié)構(gòu)，其活性中心存在Zn2+，由5個相同的氨基酸組成，分別為His94，Asp264，Glu302，Asp346和His440，其中Asp264連接2個Zn2+[18]。這5個金屬配位殘基在M18家族成員中形成嚴(yán)格保守的“H.D.E.D.H”特征。

圖3 不同來源的天冬酰胺氨肽酶的氨基酸序列比對結(jié)果Fig.3 Amino acids sequence alignment of aspartyl aminopeptidase

2.2 重組畢赤酵母的構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá)

將目的基因連接至表達(dá)載體pPIC9K上，獲得重組質(zhì)粒pPIC9K/AAP，然后用EcoRⅠ和NotⅠ進(jìn)行雙酶切驗證。如圖4所示，獲得1.5 kbp左右的目的基因片段和9.3 kbp左右的載體片段，與理論值相符。將重組質(zhì)粒進(jìn)一步測序，驗證正確，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。質(zhì)粒構(gòu)建流程如圖5所示。

M-DL2503 Marker；1-pPIC9K/AAP雙酶切產(chǎn)物圖4 pPIC9K/AAP雙酶切產(chǎn)物電泳圖Fig.4 Electrophoretogram of pPIC9K/AAP product

圖5 pPIC9K/AAP構(gòu)建示意圖Fig.5 Construction of pPIC9K/AAP

將重組質(zhì)粒pPIC9K/AAP用SacⅠ線性化后電擊轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115中，通過不同濃度的G418抗性平板篩選陽性轉(zhuǎn)化子，獲得重組畢赤酵母工程菌，每隔24 h用甲醇對重組畢赤酵母進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，其發(fā)酵液上清SDS-PAGE電泳圖如圖6所示。畢赤酵母可直接將外源蛋白分泌至胞外，如圖7所示，將重組蛋白酶的發(fā)酵上清液點接至脫脂奶粉平板上，其發(fā)酵液周圍形成明顯的蛋白水解圈，說明重組菌具有蛋白酶活性。酶活測定結(jié)果如圖8所示，重組蛋白酶在誘導(dǎo)第4天酶活達(dá)到最高，為 21.5 U/mL，此時菌體量也達(dá)到最高，OD600約為36.1。

M-蛋白質(zhì)Marker；1-重組蛋白酶發(fā)酵液上清圖6 重組菌發(fā)酵液上清SDS-PAGEFig.6 SDA-PAGE of supernatant protein

圖7 平板透明圈鑒定重組蛋白酶Fig.7 Transparent circle of recombinant protease

2.3 重組AAP的純化

收集發(fā)酵液上清，利用鎳柱對發(fā)酵液進(jìn)行純化。經(jīng)計算，純化倍數(shù)和回收率分別為2.89倍和30.2%。將純化后的重組蛋白酶進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳，結(jié)果如圖9所示。該酶相對分子質(zhì)量約為54 kDa，與根據(jù)氨基酸序列預(yù)測的相對分子質(zhì)量相符，其純度也已達(dá)到后續(xù)實驗的要求。

圖8 重組蛋白酶的搖瓶發(fā)酵Fig.8 Shake flask fermentation of recombinant protease

M-蛋白質(zhì)Marker；1-純化的重組蛋白酶圖9 純化的重組蛋白酶SDS-PAGE電泳圖Fig.9 SDS-PAGE analysis of purified recombinant protease

2.4 重組AAP的酶學(xué)性質(zhì)研究

2.4.1 最適pH、溫度及穩(wěn)定性

由圖10-A可知，該酶的最適反應(yīng)pH為7.0左右，當(dāng)pH低于6.0時，酶的活性明顯降低。由圖10-B可知，經(jīng)pH為5.5～9.5的緩沖液處理后，相對酶活仍保持在60%以上，說明該酶的pH值范圍較寬廣；當(dāng)pH低于6.0或者9.0時，酶的穩(wěn)定性迅速降低。

由圖11-A可知，該酶的最適反應(yīng)溫度為50 ℃左右，當(dāng)溫度超過60 ℃時，酶的活性迅速降低。由圖11-B可知，該酶在低于60 ℃時有較好的穩(wěn)定性，當(dāng)超過60 ℃并保溫90 min以上時，酶活極不穩(wěn)定，甚至活性全部喪失。

圖10 pH對重組蛋白酶活性(A)及穩(wěn)定性(B)的影響Fig.10 Effects of pH on the activity (A) and stability (B) of recombinant AAP

圖11 溫度對重組蛋白酶活性(A)及穩(wěn)定性(B)的影響Fig.11 Effects of temperature on the activity (A) and stability (B) of recombinant AAP

2.4.2 金屬離子及抑制劑的影響

圖12可知，10 mmol/L的IAM、PMSF和Pepstatin對該酶有輕微的抑制作用，EDTA對該酶的抑制作用十分顯著，推測該酶可能是一種金屬蛋白酶[19]。根據(jù)報道，金屬蛋白酶一般為中性蛋白酶，最適pH范圍為7.0～8.0[19]，這與該酶的最適反應(yīng)pH偏中性的結(jié)論一致。金屬蛋白酶的活性中心依賴于金屬離子(大多為Zn2+)。如圖12所示，添加10 mmol/L Zn2+可使AAP的相對酶活提高，這與結(jié)構(gòu)域預(yù)測中該酶的活性中心存在Zn2+的結(jié)果一致；另外，Ca2+對該酶也有一定的促進(jìn)作用，F(xiàn)e2+、Mn2+和K+有輕微的抑制作用，Mg2+和Co2+的抑制效果不顯著。

圖12 金屬離子及抑制劑對重組蛋白酶活性的影響Fig.12 Effects of metal ions and inhibitors on the activity of recombinant AAP

圖13 重組蛋白酶的底物特異性Fig.13 Substrate specificity of recombinant AAP

2.4.3 底物特異性及動力學(xué)分析

重組蛋白酶底物特異性如圖13所示，該酶只對Asp-pNA和Glu-pNA有水解作用，底物特異性較強，符合氨肽酶M18家族的水解特性，且對Asp-pNA的活性相當(dāng)于對Glu-pNA活性的31%，說明該酶優(yōu)先水解N末端氨基酸殘基為天冬氨酸的多肽，其次水解谷氨酸，這一特性為該酶應(yīng)用于大豆多肽的苦味的去除帶來較大的優(yōu)勢。以Asp-pNA為底物，采用Lineweaver-BurK法作圖，測得重組蛋白酶的Km為0.42 mmol/L，Vm為21.57 μmol/(mL·min)，動力學(xué)方程為y=0.0209x+0.0438，R2=0.9932。

2.5 重組蛋白酶對大豆多肽的水解及脫苦效果

大豆蛋白經(jīng)堿性蛋白酶處理后的水解度和苦味值分別為6.3%和3.3。如表2所示，當(dāng)加入1 000、4 000、8 000 U/g的重組蛋白酶后，大豆多肽的水解度分別分8.5%、14.6%、20.0%，分別提高了2.2%，8.3%和13.3%?？梢?，重組蛋白酶可以提高大豆多肽的水解度。感官評定發(fā)現(xiàn)，水解液的苦味值由原來的3.9分別降低到3.3、2.4、1.9，說明重組蛋白酶對大豆多肽有較好的脫苦作用。

表2 不同濃度重組蛋白酶對大豆多肽的水解度及苦味值的影響Table 2 The degree of hydrdysis (DH) of soybean peptidesby recombinant AAP at different concentrations and theirbitterness scores

3 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)了源于米曲霉的天冬酰胺氨肽酶新基因AAP，并在畢赤酵母GS115中實現(xiàn)分泌表達(dá)，對該酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，將其應(yīng)用于大豆多肽的脫苦中，發(fā)現(xiàn)大豆多肽的苦味明顯降低同時水解度升高。重組AAP的加入，不僅可以使水解液的苦味降低，而且使多肽鏈末端呈鮮味的天冬氨酸和谷氨酸大量釋放，作為一種新型的風(fēng)味酶在大豆多肽脫苦及調(diào)味品方面具有很好的應(yīng)用前景，展現(xiàn)了其在食品行業(yè)中的應(yīng)用潛力。