劉逸凡，蔡國林*，李曉敏，陸健*

1 (工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122) 2 (糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122) 3(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum) 是健康動物和人類腸道菌群的重要組成部分。作為益生菌，它可以促進(jìn)其他有益菌的增殖、抑制病原菌生長、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、改善動物生長性能等作用[1-3]，廣泛用于食品，畜牧業(yè)，醫(yī)藥和水產(chǎn)品等領(lǐng)域[4-6]。丁酸梭菌作為厭氧菌，主要從腸道和土壤中篩選，目前，普遍采用強(qiáng)化梭菌培養(yǎng)基(reinforced medium forClostridia，RCM)進(jìn)行篩選。然而，由于丁酸梭菌不是腸道和土壤中的優(yōu)勢菌株，其生長受到其他產(chǎn)孢桿菌及產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑制，造成篩菌周期長，特異性不高的問題。因此，優(yōu)化丁酸梭菌的篩選培養(yǎng)基可以提高篩菌效率，有利于分離獲得功能特異的目標(biāo)菌株。

益生菌的代謝產(chǎn)物是其益生作用的重要因素[7]，比如，益生菌代謝產(chǎn)生的短鏈脂肪酸可為宿主提供營養(yǎng)物質(zhì)，酶類物質(zhì)可幫助宿主提高營養(yǎng)物質(zhì)的消化利用率，磷壁酸能夠抑制大腸桿菌對腸上皮細(xì)胞的黏附作用等[8-10]。最近的研究認(rèn)為益生菌的胞外多糖(exopolysaccharides, EPS)是一種天然無毒的抗氧化劑，是其生理功能的重要物質(zhì)，如植物乳桿菌YW32產(chǎn)生的胞外多糖具有清除羥基自由基和超氧自由基的能力且對多種致病菌生物膜的形成具有濃度依賴性的抑制作用[11]。植物乳桿菌BR2在顯示強(qiáng)抗氧化活性的同時對H9C2的正常細(xì)胞沒有產(chǎn)生任何毒性[12]。然而，目前對丁酸梭菌EPS及其功能的研究鮮有報(bào)道。

本研究通過改良丁酸梭菌篩選培養(yǎng)基，從動物腸道中篩選得到高產(chǎn)EPS的丁酸梭菌，并對其EPS的抗氧化性質(zhì)進(jìn)行研究，為丁酸梭菌及其EPS的生產(chǎn)和使用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品

無錫市蘆莊農(nóng)貿(mào)市場現(xiàn)宰雞腸道內(nèi)容物。

1.2 培養(yǎng)基

梭菌增殖培養(yǎng)基(RCM培養(yǎng)基)(g)：酵母浸膏3，牛肉膏10，胰蛋白胨10，葡萄糖5，可溶性淀粉1，NaCl 5，醋酸鈉3，L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5，蒸餾水1 000 mL，pH值為6.8，121℃滅菌15 min，固體培養(yǎng)基中加入瓊脂20。

改良篩選培養(yǎng)基：在RCM培養(yǎng)基中加入正丁酸0.5 g，多黏霉素B 0.02 g。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g)：蔗糖30，蛋白胨10，酵母膏0.5，Na2HPO4·12H2O 4，NaH2PO4·2H2O 1，L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5，MgSO4·7H2O 0.2，蒸餾水1 000 mL，pH值為7.0。

1.3 主要試劑

細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒、rTaq(含Taq酶(5 U/μL)、dNTP和buffer)，生工生物工程(上海)股份有限公司；藥敏試紙，杭州微生物試劑有限公司；人工胃液、人工腸液,根據(jù)中國藥典進(jìn)行配制。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器與儀器設(shè)備

GI54DWS自動高壓蒸汽滅菌設(shè)備，致微(廈門)儀器有限公司；Centrifuge 5415D離心機(jī)、Mastercycler pro PCR儀，德國Eppendorf公司；FE20精密pH計(jì)，Mettler Toledo公司；紫外-可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；日立U-3900紫外可見分光光度計(jì)，日本日立株式會社；真空冷凍干燥機(jī)，美國Labconco公司。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 菌株初篩

取3只雞盲腸內(nèi)容物各1 g，混勻，取其中1 g加入9 mL的PBS緩沖液中，置于80 ℃水浴熱處理10 min。取100 μL樣品置于RCM培養(yǎng)基中37 ℃厭氧富集培養(yǎng)24 h。將富集培養(yǎng)得到的樣品分別稀釋到10-2，10-4，10-6，取100 μL涂布于篩菌培養(yǎng)基平板上，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，挑選嚴(yán)格厭氧生長菌株進(jìn)行鏡檢，對分離得到的具有梭菌屬特征的菌株進(jìn)行明膠液化實(shí)驗(yàn)、水解淀粉實(shí)驗(yàn)、糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)以及菌落拉絲實(shí)驗(yàn)。

1.5.2 產(chǎn)EPS丁酸梭菌的復(fù)篩

將初篩得到的產(chǎn)胞外多糖較多的菌株使用發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，取20 mL發(fā)酵液，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%的三氯乙酸溶液至質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%，4 ℃靜置過夜。4 ℃、10 000×g離心20 min，取上清液，去離子水透析3 d，每6 h換水1次，定容。以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)，采用苯酚-硫酸法[13]測定多糖含量。

1.5.3 菌株形態(tài)學(xué)鑒定

將篩選得到的菌株在RCM固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h后對菌株的菌落形態(tài)、顏色、菌落邊緣等特征進(jìn)行觀察并記錄，并挑取菌落進(jìn)行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察菌體形狀、大小。

1.5.4 菌株的鑒定

將篩選得到的胞外多糖高產(chǎn)菌株進(jìn)行16S rDNA基因序列分析，使用提取試劑盒提取菌株的全基因組，采用熊濤等[14]的方法進(jìn)行PCR，其擴(kuò)增后的片段送于生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行序列測定，最后把所得菌株的DNA序列信息輸入美國國家生物信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行局部序列比對，用基本檢索工具(basic local alignment search tool，BLAST)進(jìn)行分析，并繪制發(fā)育樹。

膽鹽耐受性測試[15]：將活化后的菌種接種于含有質(zhì)量濃度為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45 g/L牛膽鹽的RCM培養(yǎng)基中，厭氧培養(yǎng)24 h后觀察其生長情況，并稀釋涂布于RCM平板上，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h后進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

人工胃液和人工腸液耐受性測試[16]：取丁酸梭菌生長末期的液體培養(yǎng)物3 000×g離心10 min，使用0.2 mol/L PBS緩沖液洗滌菌體2次，并用PBS緩沖液將菌體稀釋至107CFU/mL，將稀釋液接種于人工胃液中，混勻后在37 ℃水浴，并每0.5 h取樣計(jì)數(shù)。將人工腸液處理后的菌體3 000×g離心10 min，PBS緩沖液洗滌2次，并用PBS重懸菌株至107CFU/mL，將重懸菌體接種至人工腸液中，按照上述條件進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

抗生素敏感性測試[17]：將100 μL濃度為108CFU/mL的丁酸梭菌用無菌玻璃棒接種于RCM固體培養(yǎng)基上，取藥敏試紙置于培養(yǎng)基表面，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，測量抑菌圈直徑，根據(jù)說明書標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定。

1.5.6 多糖的制備

取發(fā)酵48 h的發(fā)酵液，沸水浴10 min，然后4 ℃、10 000×g離心10 min除去菌體和凝結(jié)蛋白，上清液濃縮后加入3倍體積的預(yù)冷無水乙醇，4 ℃靜置過夜。4 ℃、10 000×g離心20 min，取沉淀用去離子水溶解，并采用蛋白酶及Sevag聯(lián)用法去除蛋白質(zhì)[18]，4 ℃、10 000×g離心20 min，取上清置于透析袋中透析3 d，每6 h換水1次，冷凍干燥得粗多糖。將EPS重新溶解于去離子水至10 mg/mL，將10 mL EPS溶液通過DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換色譜柱(26 mm×200 mm)，分別用去離子水，0.2 mol/L NaCl和0.5 mol/L NaCl溶液洗脫，流速為1 mL/min，檢測每管EPS含量后合并EPS洗脫液。透析、凍干后再用適量去離子水溶解，并用Sepharose CL-6B柱(16 mm×500 mm)進(jìn)一步純化，使用 50 mmol/L磷酸鹽(pH值為7.0)以0.5 mL/min的流速洗脫，檢測每管EPS含量，合并EPS洗脫液，透析并凍干。

1.5.7 多糖抗氧化活性測定

對羥基自由基(·OH)的清除活性測定：實(shí)驗(yàn)使用H2O2-FeSO4體系研究胞外多糖對·OH的清除作用。反應(yīng)體系3.0 mL，分別含有25 mmol/L的FeSO4，2 mmol/L的水楊酸鈉，6 mmol/L的H2O2，純化EPS(0.05、0.25、0.5、0.75、1 mg)。將整個混合體系置于37 ℃恒溫培養(yǎng)1 h，在510 nm測定吸光值，分別以不含EPS組和同等濃度的Vc作為空白和陽性對照，以公式(1)計(jì)算羥基自由基的清除活性[19]。

傳統(tǒng)的課程考核方法主要是通過考試考核學(xué)生對理論知識的掌握程度,這種一次性的考核方法不能真正地反映出學(xué)生對所學(xué)知識的掌握程度及其專業(yè)應(yīng)用能力,而一個良好的評價體系能夠激起學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣和積極性。

(1)

(2)

1.5.8 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0進(jìn)行，每個實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，并進(jìn)行單因素方差分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 丁酸梭菌的篩選

將雞盲腸內(nèi)容物通過熱處理，梭菌強(qiáng)化培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)后進(jìn)行篩選，在RCM固體平板上篩選結(jié)果如圖1-A所示，菌落種類較多，且多數(shù)菌落和目標(biāo)菌落形態(tài)差異較大，導(dǎo)致篩選難度較大。因此，在RCM培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加正丁酸和多黏霉素B，在改良丁酸梭菌篩選培養(yǎng)基上的生長結(jié)果如圖1-B所示。多黏霉素B可抑制革蘭氏陰性菌的生長，且由于丁酸是丁酸梭菌的代謝產(chǎn)物，其自身對丁酸具有較強(qiáng)的耐受性，因而一定濃度的正丁酸可以抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌和其他芽孢桿菌的生長。生長較好的菌株和目標(biāo)菌株形態(tài)較為相似，篩選較為容易，挑選在平板上為不透明白色或奶油色，菌落邊緣整齊，表面光滑，有酸臭味的菌落。初步分離得到了56株符合梭菌屬細(xì)菌生長特性的分離株，編號為RO-01～RO-56，對分離得到的這些菌株進(jìn)行明膠液化實(shí)驗(yàn)、水解淀粉實(shí)驗(yàn)、糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)以及菌落拉絲實(shí)驗(yàn)，將鑒定得到符合目標(biāo)菌株生長特性的菌株通過菌落拉絲法進(jìn)一步篩選，最終得到8株菌落有明顯拉絲的菌株RO-03、RO-07、RO-15、 RO-22、RO-29、RO-33、RO-42、RO-49。

A-RCM培養(yǎng)基；B-篩選培養(yǎng)基圖1 RCM培養(yǎng)基和篩選培養(yǎng)基上菌落的生長情況Fig.1 Colonial morphology on RCM medium and improved screening medium

2.2 高產(chǎn)EPS丁酸梭菌的篩選

分別將初篩得到的不同菌株接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵結(jié)束后離心，將其上清液經(jīng)過透析后采用蒽酮-硫酸法檢測多糖的含量，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，不同菌株EPS產(chǎn)量差異較大，選取產(chǎn)胞外多糖最高的菌株RO-07進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 不同菌株EPS產(chǎn)量的比較Fig.2 Results of EPS produced by different strains

2.3 菌株形態(tài)學(xué)鑒定

將篩選得到的菌株RO-07在RCM固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h后可觀察其形態(tài),如圖3-A所示。

圖3 丁酸梭菌RO-07菌落形態(tài)和菌體形態(tài)圖Fig.3 Colonial and cell morphology of Clostridiumbutyricum RO-07

菌落成乳白色圓形，菌落表面稍突且邊緣整齊，表明光滑且濕潤。挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，結(jié)果如圖3-B所示。細(xì)菌呈直桿狀或稍有彎曲，兩端鈍圓，單個或成對，孢子卵圓，次端生。

2.4 菌株分子生物學(xué)鑒定

以菌株RO-07的DNA為模板，使用16S rDNA通用引物進(jìn)行擴(kuò)增，并將擴(kuò)增產(chǎn)物連接至pMD-19T載體后進(jìn)行測序，獲得長度為1 567 bp的序列，將菌株的基因序列在NCBI上進(jìn)行Blast分析比對，結(jié)果表明該菌株與丁酸梭菌的同源性最高。根據(jù)基因序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖4)，并結(jié)合菌株生理生化特性進(jìn)行分析，最終確定該菌株為丁酸梭菌RO-07。

圖4 菌株RO-07的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequence of RO-07 strain

2.5 菌株體外生長特性

動物小腸中膽汁濃度在0.03%～0.3%波動[21]，食物通過腸道時間約2～3 h。在RCM液體培養(yǎng)基中加入牛膽鹽至質(zhì)量濃度0.5～4.5 g/L，將丁酸梭菌RO-07接種于含有牛膽鹽的RCM培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察含不同濃度牛膽鹽培養(yǎng)基中菌株的生長情況，并對活菌進(jìn)行計(jì)數(shù)，如表1所示。結(jié)果表明該菌株對質(zhì)量濃度0.5～4.0 g/L的牛膽鹽具有良好的耐受性。

丁酸梭菌RO-07在人工腸液和胃液中的耐受性結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明，人工胃液對丁酸梭菌RO-07的存活情況沒有明顯的影響，同時，經(jīng)過人工胃液處理后的菌株對人工腸液也有很好的耐受性，在作用3 h后，丁酸梭菌RO-07數(shù)量依然沒有明顯改變。

表2 丁酸梭菌RO-07人工胃液和人工腸液的耐受性研究Table 2 Resistance of Clostridium butyricum RO-07 insynthetic gastric juice and synthetic intestinal fluid

丁酸梭菌RO-07對抗生素耐藥性結(jié)果如表3所示。該菌株對四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)脂類、青霉素類抗生素較為敏感，在生產(chǎn)加工過程中不宜共同使用；丁酸梭菌RO-07對氨基糖苷類抗生素敏感性較弱，因而在生產(chǎn)加工過程可考慮配伍使用。

表3 丁酸梭菌RO-07藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of Clostridium butyricum RO-07antibiotic resistance

注：S為敏感，I為中度敏感，R為耐藥。

2.6 胞外多糖抗氧化性的研究

強(qiáng)氧化劑如羥基自由基及其衍生物可與活細(xì)胞中的大部分生物大分子發(fā)生反應(yīng)，引起嚴(yán)重的生物學(xué)損傷[22]。丁酸梭菌EPS對·OH的清除活性檢測結(jié)果如圖5所示。隨著EPS濃度的增加，其·OH清除活性從34.5%增加到到75.2%，而相同濃度的Vc對·OH清除活性從5.7%增加到62%，明顯低于EPS。因此，丁酸梭菌RO-07的EPS可能是·OH的有效清除劑，能夠在病理?xiàng)l件下防止由羥基自由基引起的損傷。

圖5 多糖對·OH的清除活性Fig.5 Hydroxyl radical scavenging activity of EPS

圖6 多糖對的清除活性Fig.6 Superoxide radical scavenging activity of EPS

3 結(jié)論