蔡國林，馮文旭，劉逸凡，李曉敏，陸健*

1(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122)2(糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122)3(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

芽孢桿菌可以調(diào)節(jié)動物腸道菌群，不但可以降低腸道疾病的風(fēng)險，特別是由產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(enterotoxigenicEscherichiacoli, ETEC)導(dǎo)致的腹瀉，還可以提高動物的生長性能，因此被廣泛應(yīng)用于動物養(yǎng)殖中[1-2]。商品化的芽孢桿菌一般以孢子形式存在，由于芽孢耐熱，且具有低pH耐受性，有益于飼料的加工及腸道的存活率。大約10%的芽孢能最終在動物的消化道內(nèi)重新萌發(fā)[3]。芽孢在重新萌發(fā)、生長和增殖的過程中，會消耗系統(tǒng)內(nèi)的氧氣，促進(jìn)乳酸菌和雙歧桿菌等有益菌的生長，并產(chǎn)生一系列有益的代謝產(chǎn)物，如各種有益于飼料養(yǎng)分降解的消化酶和抑制有害微生物生長的抗菌肽等[4]。

然而，最近的研究表明，益生菌產(chǎn)生的胞外多糖也是其益生作用的重要方面。比如來自植物乳桿菌的胞外多糖具有類似抗壞血酸的抗氧化性能，以及降低膽固醇和抑制α-淀粉酶的能力[5]；胞外多糖還可以選擇性地促進(jìn)有益菌的增殖，進(jìn)而抑制有害菌的增殖和有害物質(zhì)的產(chǎn)生[6]；有些乳酸菌的胞外多糖能夠去除重金屬離子，阻止其在腸道中被吸收而進(jìn)入血液[7]；此外，多種乳酸菌的胞外多糖還表現(xiàn)出調(diào)節(jié)宿主免疫性能和抑制腫瘤細(xì)胞增殖的能力[8]。然而，目前對芽孢桿菌胞外多糖的益生作用研究很少，僅有文獻(xiàn)報道芽孢桿菌胞外多糖具有抗氧化作用[9]，這不利于深入研究芽孢桿菌益生作用的機(jī)理及其精準(zhǔn)調(diào)控。目前防治ETEC導(dǎo)致的腹瀉主要是采用抗生素治療，這可能導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性增強(qiáng)和食品中藥物殘留等問題，而卵黃抗體粉和多價疫苗等新型的防治手段，導(dǎo)致養(yǎng)殖成本增加大，難以被養(yǎng)殖企業(yè)所接受。

本研究主要通過篩選獲得高產(chǎn)胞外多糖的芽孢桿菌，考察其胞外多糖對ETEC介導(dǎo)的血凝反應(yīng)的抑制作用，結(jié)合芽孢桿菌耐受人工腸、胃液和抗生素敏感性，評價其飼用益生潛力，為今后在動物養(yǎng)殖中的應(yīng)用及研究其胞外多糖對大腸桿菌病的精準(zhǔn)防治奠定良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 芽孢桿菌的分離與初步篩選

取新鮮的健康仔豬糞約1 g于100 mL無菌的生理鹽水中，80 ℃水浴30 min，將處理后的樣品稀釋涂布于LB平板。30 ℃培養(yǎng)48 h后挑取典型的芽孢桿菌菌落，在新鮮的LB平板上純化培養(yǎng)24 h，挑取單菌落至LB斜面保藏備用。

將保藏的菌株分別在LB液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h，采用平板計數(shù)法測定活菌總數(shù)A0，菌液經(jīng)80 ℃處理30 min后，采用平板計數(shù)法測定芽孢數(shù)A1。菌株的產(chǎn)孢率按公式(1)計算[10]。

(1)

1.2 芽孢桿菌胞外多糖產(chǎn)量分析

將分離獲得的高產(chǎn)孢率的芽孢桿菌接種于含100 g/L蔗糖的LB培養(yǎng)基中37 ℃發(fā)酵72 h。發(fā)酵液經(jīng)8 000×g離心30 min，去除菌體與雜質(zhì)，上清液中加入3倍體積無水乙醇，于4 ℃過夜沉淀，8 000×g離心30 min去除上清，將沉淀用去離子水復(fù)溶后，經(jīng)8 000 u透析袋透析2 d，每隔8 h換水，收集透析液并定容，采用苯酚-硫酸法測定胞外多糖的含量[11]。

1.3 芽孢桿菌胞外多糖抑制血凝反應(yīng)能力分析

血紅細(xì)胞的血凝反應(yīng)通過ETEC介導(dǎo)，按照WANG等[12]的方法進(jìn)行，ETEC CICC10421 (O78∶K80)購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心。采集新鮮雞血用PBS生理鹽水(100 mmol/L，pH 7.2)反復(fù)洗滌離心5次，最后用PBS生理鹽水將紅細(xì)胞懸浮液稀釋為50 g/L，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩TEC在Minca瓊脂上培養(yǎng)過夜，然后用PBS生理鹽水沖洗，制備8.0×109CFU/mL的菌懸液。取25 μL含有8.0×109細(xì)菌細(xì)胞的ETEC懸浮液置于圓底96孔板中并且稀釋2倍，加入25 μL含有不同濃度的芽孢桿菌胞外多糖(以甘露聚糖為陽性對照)，室溫放置5 min。最后加入25 μL懸浮在PBS中的5%紅細(xì)胞懸浮液輕輕混合。在4 ℃放置2 h后觀察96孔板中紅細(xì)胞凝集情況，記錄首次出現(xiàn)抑制血凝反應(yīng)的多糖濃度。

Minca瓊脂：KH2PO41.36 g， Na2HPO4·2H2O 10.1 g，葡萄糖1 g，酪蛋白氨基酸1 g，去離子水1 000 mL，1 mL微量鹽溶液(MgSO4·7H2O 10 g，MnCl2·4H2O 1 g，F(xiàn)eCl3·6H2O 0.135 g，CaCl2·4H2O 0.4 g, 去離子水1 000 mL)，瓊脂12 g。

1.4 芽孢桿菌耐胃酸和腸液能力分析[13]

人工胃液：將1.0 g胃蛋白酶充分溶解于100 mL的生理鹽水中，用2 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH值分別為2.0、3.0和4.0，采用0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌，備用。人工腸液：取KH2PO46.8 g，加蒸餾水500 mL溶解，用0.1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH至6.8，加水定容至1 000 mL，加入1.0 g胰蛋白酶和3.0 g牛膽鹽，充分溶解后經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌，備用。

將1 mL芽孢懸浮液(1.0×108CFU/mL)接入9 mL人工胃液，37 ℃振蕩水浴處理2 h后進(jìn)行活菌計數(shù)，每個處理重復(fù)3次。將經(jīng)過pH 3.0人工胃液處理后的芽孢離心，生理鹽水洗滌2次后重新懸浮，以1.0×107CFU/mL接種于上述人工腸液中，37℃振蕩水浴處理，分別在0.5、1、2 h取樣進(jìn)行活菌計數(shù)，每個處理重復(fù)3次。

1.5 抗生素抗性和產(chǎn)抗生素能力分析

抗生素敏感實(shí)驗(yàn)根據(jù)Clinical and Laboratory Standards Institute推薦的擴(kuò)散平板法進(jìn)行[14]。實(shí)驗(yàn)的10種常規(guī)抗生素采用市售藥敏紙片，將芽孢桿菌均勻分布于LB平板上(107CFU/mL)，攝取各種抗菌紙片，分別緊貼于培養(yǎng)基表面，置于37 ℃培養(yǎng)24 h，測量抑菌圈的直徑。直徑大于15 mm為高敏，直徑15 mm以下為中敏，無抑菌環(huán)為不敏感。

1.6 菌種鑒定

采用表型特征結(jié)合16 S rRNA序列分析進(jìn)行菌種鑒定[16]。按照提取細(xì)菌基因組的試劑盒說明書流程提取細(xì)菌DNA，經(jīng)過PCR擴(kuò)增，測序，將最終得到的基因序列在NCBI上進(jìn)行Blast比對分析，并將比對后的數(shù)據(jù)應(yīng)用MEGA 5.0 軟件進(jìn)行基因系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建和基因系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析。

1.7 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0進(jìn)行，每個實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，并進(jìn)行單因素方差分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 芽孢桿菌的分離與初步篩選

從5個健康仔豬糞便共分離得到225株芽孢桿菌，其中28株芽孢桿菌的芽孢生成率在90%以上，且它們的芽孢經(jīng)過80 ℃處理30分鐘后，萌發(fā)率在95%以上。選取產(chǎn)孢率超過90%的菌株進(jìn)行后續(xù)研究。對初步分離獲得的28株芽孢桿菌在100 g/L蔗糖的LB培養(yǎng)基發(fā)酵，測定其胞外多糖含量，頻數(shù)分布如圖1所示。

圖1 芽孢桿菌胞外多糖產(chǎn)量頻數(shù)分布圖Fig.1 The frequency distribution of exopolysaccharide yield of isolated Bacillus strains

從圖1可知，芽孢桿菌胞外多糖產(chǎn)量差異明顯，其中胞外多糖產(chǎn)量在20 g/L以上的有4株，將這4株重新命名為JN1，JN2，JN3和JN4，進(jìn)行下一步的胞外多糖抑制ETEC介導(dǎo)的血凝反應(yīng)的能力評價。

2.2 芽孢桿菌胞外多糖對血凝反應(yīng)的抑制作用

考察4株芽孢桿菌JN1，JN2，JN3和JN4胞外多糖對ETEC介導(dǎo)的血紅細(xì)胞血凝反應(yīng)的抑制作用，如表1所示。芽孢桿菌JN4的胞外多糖在4 mg/mL時就能抑制血凝反應(yīng)，而芽孢桿菌JN1和JN2的胞外多糖在8 mg/mL時能抑制血凝反應(yīng)，都和商品甘露聚糖在12 mg/mL時才抑制血凝反應(yīng)有明顯的差異(P<0.05)，但芽孢桿菌JN3的胞外多糖在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度內(nèi)(12 mg/mL)都沒有抑制作用。不同芽孢桿菌胞外多糖對ETEC介導(dǎo)的血凝反應(yīng)具有不同的抑制作用，可能和多糖的組成和結(jié)構(gòu)有關(guān)，不同的單糖組成和分子結(jié)構(gòu)與ETEC細(xì)胞表面蛋白的結(jié)合能力不同[15]。

表1 芽孢桿菌胞外多糖對血凝反應(yīng)的抑制作用Table 1 The inhibition effects of exopolysaccharide fromBacillus on hemagglutination of porcine erythrocytesby enterotoxigenic Escherichia coli

注：“+”表示有抑制作用，“-”表示沒有抑制作用。

ETEC是一種常見的導(dǎo)致動物腹瀉的致病菌，它可以和腸道細(xì)胞的蛋白特異性結(jié)合，從而在腸道內(nèi)定殖，并迅速繁殖，產(chǎn)生腸毒素，進(jìn)而導(dǎo)致腹瀉，嚴(yán)重時可導(dǎo)致死亡[16]。目前，由于商品的寡糖和多糖可以有效地和ETEC結(jié)合(抑制血凝反應(yīng))，而被應(yīng)用于預(yù)防ETEC大腸桿菌病，但大部分寡糖和多糖的有效抑制濃度為16 mg/mL[17]。芽孢桿菌JN4胞外多糖在低濃度下(4 mg/mL)即可有效抑制ETEC介導(dǎo)的血凝反應(yīng)，表明其具有非常重要的預(yù)防和治療ETEC大腸桿菌病的應(yīng)用前景。更重要的是，益生菌雖然在預(yù)防和治療大腸桿菌病上具有較好的效果，但不同的菌株效果不同，因此，通過多糖對ETEC血凝性的抑制能力和多糖產(chǎn)量的綜合評價，可以用于定向篩選有效防治ETEC大腸桿菌病的益生菌。

2.3 芽孢桿菌胞及其芽孢的人工胃、腸液耐受能力

芽孢桿菌可以作為益生菌首先它需要耐受腸胃液的消化，才能在腸道定殖，形成有益代謝產(chǎn)物，考察芽孢桿菌JN4的人工胃液耐受能力如表2所示。從表2中可知，芽孢桿菌JN4的芽孢在人工胃液下具有很高的存活率，在pH 3和4處理3 h，芽孢的存活率超過89%，在pH 2處理條件下存活率也超過80%。然而，芽孢桿菌JN4營養(yǎng)體的人工胃液耐受能力很差，在pH 3和4處理3 h后，存活率僅在10%左右。

表2 芽孢桿菌JN4及其芽孢的人工胃液耐受能力Table 2 Effect of simulated gastric environment on thesurvival rates of Bacillus JN4

注：同列間標(biāo)有不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

芽孢桿菌JN4的芽孢同樣具有很好的腸液耐受能力(圖2)，表明攝入的芽孢可以耐受動物的胃腸液，從而可能在腸道內(nèi)萌發(fā)、定殖。但是，芽孢桿菌JN4的營養(yǎng)體在人工腸液下的耐受能力較差，在人工腸液下2 h后僅有10%的營養(yǎng)體存活。因此，雖然研究證明芽孢桿菌可以在厭氧條件下生長、代謝，從而起到益生作用，但考慮到其營養(yǎng)體在較高膽鹽濃度下存活率較差，需要攝入足夠量的孢子才能起到有效的作用。

圖2 芽孢和營養(yǎng)體在人工腸液下的耐受性Fig.2 The tolerance of spores and vegetative cells toward simulated small intestinal juice

2.4 芽孢桿菌的抗生素敏感性

抗生素敏感性是益生菌使用是否能安全使用，不會產(chǎn)生耐藥性傳遞的重要指標(biāo)，芽孢桿菌JN4對10中常見抗生素，包括青霉素、慶大霉素、卡那霉素、新霉素、四環(huán)素、紅霉素、氯霉素、萬古霉素、鏈霉素和環(huán)丙沙星的敏感性如表3所示。

表3 芽孢桿菌JN4的抗生素敏感性Table 3 Antibiotic susceptibility test of Bacillus JN4

注：*括號中的數(shù)值表示抗生素濃度(μg/L)；#括號中表示抗生素敏感程度，S：敏感；M：中度敏感。

由表3可知，芽孢桿菌JN4對大部分的抗生素敏感，僅對青霉素中度敏感。

2.5 芽孢桿菌JN4的鑒定

采用生理生化特性結(jié)合16 S rRNA分析對芽孢桿菌JN4進(jìn)行鑒定，芽孢桿菌JN4具有很強(qiáng)的淀粉分解能力，菌體直徑小于1 μm，芽孢中生，在含有65 g/L NaCl的LB培養(yǎng)基上可以生長，具有酪蛋白和明膠分解能力。結(jié)合其16 S rRNA測序，并經(jīng)BLAST分析，鑒定其為解淀粉芽孢桿菌JN4，構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹如圖3所示。

圖3 芽孢桿菌JN4的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree based on the 16 S rRNA amongBacillus JN4 and related strains

3 結(jié)論

分離獲得了1株高產(chǎn)胞外多糖的解淀粉芽孢桿菌JN4，其胞外多糖在4 mg/mL時就能抑制ETEC介導(dǎo)的血紅細(xì)胞凝集反應(yīng)。體外實(shí)驗(yàn)表明，解淀粉芽孢桿菌JN4的芽孢可以耐受人工腸胃液環(huán)境，且對常見的抗生素敏感，是理想的用于有效防治ETEC導(dǎo)致的大腸桿菌病的飼用益生菌。