陳笑，李江華*，劉松，堵國成

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122) 2(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122)

谷氨酰胺酶(glutaminase，EC 3. 5. 1. 2)廣泛存在于細(xì)菌、酵母菌、真菌等微生物中，是生物體氮代謝過程中的關(guān)鍵酶，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)療等多個領(lǐng)域[1-2]。某些微生物來源的谷氨酰胺酶可以催化谷氨酰胺的γ-谷氨酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，制備一種功能性食品添加劑——茶氨酸，比如硝基還原假單胞菌(Pseudomonasnitroreducens)[3]。在醬油釀造業(yè)中，利用L-谷氨酰胺酶水解谷氨酰胺生成具有鮮味的氨基酸——谷氨酸，醬油曲料中的谷氨酰胺酶的酶活力是影響醬油發(fā)酵中L-谷氨酸得率的關(guān)鍵因素[4]。WAKAYAMA等[5]將來自嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(StenotrophomonasmaltophiliaNYW-81)的谷氨酰胺酶純化至均一，該酶比酶活為325 U/mg，具有較高的耐鹽性和熱穩(wěn)定性。在添加S.maltophilia谷氨酰胺酶的模型反應(yīng)中，谷氨酸的濃度是添加米曲霉(Aspergillusoryzae)谷氨酰胺酶的4倍，是添加藤黃微球菌(MicrococcusluteusK-3)谷氨酰胺酶的2.6倍，該酶顯示出較高的谷氨酸生產(chǎn)能力。此外，谷氨酰胺酶能特異性水解植物蛋白中谷氨酰胺殘基的胺?；岣叩鞍踪|(zhì)的功能性質(zhì)[6]。

目前大部分谷氨酰胺酶熱穩(wěn)定性較低，限制了其在醬油釀造等高溫環(huán)境中的應(yīng)用[7]。為提高谷氨酰胺酶的應(yīng)用效果，人們開始重視它的穩(wěn)定性研究。DURA等[8]研究發(fā)現(xiàn)，添加乙二胺四乙酸和乙二醇可使德巴利酵母屬(Debaryomycesspp. CECT 11815)谷氨酰胺酶的半衰期(t1/2，25 ℃)分別提高29%和43%。MATSUURA等[9]將大腸桿菌(Escherichiacoli)谷氨酰胺酶封裝于Santa Barbara Amorphous(SBA)顆粒中形成酶-SBA10.6 復(fù)合物，其60 ℃下熱穩(wěn)定性較固定化前提高3.3倍。盡管相關(guān)研究一定程度上提高了谷氨酰胺酶的熱穩(wěn)定性，但僅局限于酶穩(wěn)定劑篩選及固定化，缺乏對酶分子自身穩(wěn)定性的改造。

隨著生物信息學(xué)的發(fā)展，部分軟件可以利用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)計算氨基酸突變能(如Discovery Studio[10-11]等)，預(yù)測影響蛋白穩(wěn)定性的關(guān)鍵氨基酸。李廣林等[12]通過設(shè)計點突變和二硫鍵位置的策略，構(gòu)建篩選庫(36個單點突變體)提高脂肪酶熱穩(wěn)定性。最穩(wěn)定的突變體Tm值提高14.3 ℃，半衰期(t1/2，70 ℃)提高12.5倍，催化效率提高39%。合理的計算方法能減少篩選突變克隆的數(shù)量，減少工作量，高效篩選出優(yōu)良突變株。最近的研究表明，蛋白質(zhì)中排斥靜電相互作用會破壞蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。KOIDE等[13]發(fā)現(xiàn)人纖連蛋白(FNfn10)的第10個纖連蛋白III型結(jié)構(gòu)域在酸性環(huán)境中比中性環(huán)境中穩(wěn)定，其中Asp23、Glu9和Asp7在FNfn10表面形成帶負(fù)電的斑塊，表明在中性環(huán)境中存在排斥的靜電相互作用。突變體D7N和D7K表現(xiàn)出適應(yīng)性且穩(wěn)定性不再依賴pH，推測減少蛋白中不利相互作用有利于提高蛋白穩(wěn)定性。鄭鵬[14]為評估靜電相互作用對小蛋白GB1的機械穩(wěn)定性的影響，將雙組氨酸基設(shè)計到GB1的受力區(qū)域中，改變pH值His可以在質(zhì)子化和去質(zhì)子化之間切換，在酸性條件下兩個帶正電荷His靜電排斥作用強，GB1機械穩(wěn)定性降低34%。因此可以通過優(yōu)化蛋白質(zhì)靜電相互作用的方法提高蛋白穩(wěn)定性。

本研究以枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis168)的谷氨酰胺酶(YbgJ)為研究對象，利用DS 2017(BIOVIA，美國)對酶分子中具有不利相互作用的49個氨基酸進行虛擬突變，確定了影響酶熱穩(wěn)定性的關(guān)鍵氨基酸位點進行飽和突變，獲得熱穩(wěn)定提高的突變體。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株與質(zhì)粒：表達質(zhì)粒pP43NMK、大腸桿菌(EscherichiacoliJM109)及宿主枯草芽孢桿菌(BacillussubtilisWB600)，來源于本實驗室前期構(gòu)建保存。質(zhì)粒pP43NMK-YbgJ為作者實驗前期構(gòu)建。

種子培養(yǎng)基(LB，g/L)：酵母粉5，胰蛋白胨10，NaCl 10。

發(fā)酵培養(yǎng)基(TB，g/L)：酵母粉24，胰蛋白胨12，甘油4，K2HPO416.43，KH2PO42.31，調(diào)節(jié)pH至7.0，于121 ℃，0. 08 MPa下滅菌20 min。

固體培養(yǎng)基是在液體培養(yǎng)基中加2%的瓊脂。

重組大腸桿菌用LB培養(yǎng)基(含100 μg/mL氨芐霉素)進行培養(yǎng)和篩選；重組枯草芽孢桿菌用LB培養(yǎng)基(含80 μg/mL卡納霉素)進行培養(yǎng)和篩選

酶、試劑、引物和DNA序列測定：限制性核酸內(nèi)切酶購自Thermo Fisher Scientific公司，膠回收試劑盒和Competent Cell Preparation Kit試劑盒購自Takara(大連)公司，Bradford蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天公司。引物合成和DNA測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 軟件分析

利用DS對YbgJ(PDB，1mki)分子中具有不利相互作用的49個氨基酸位點進行虛擬突變，計算出突變體與野生型的結(jié)合自由能差值[ΔΔGmut=ΔGbind(mut)-ΔGbind(WT)]。根據(jù)能量值高低對突變體排序，選擇前3個氨基酸位點E3、E55、D213進行飽和突變實驗。利用在線服務(wù)器SWISS-MODEL (http://swissmodel.expasy.org/)，以YbgJ為模板構(gòu)建突變體的模擬結(jié)構(gòu)。

1.2.2 YbgJ突變體的構(gòu)建及表達

以pP43NMK-YbgJ質(zhì)粒為模板，通過PCR引入突變氨基酸(引物如表1)。PCR循環(huán)數(shù)為15，PCR結(jié)束后利用DpnI消化模板1 h，柱回收后回收產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliJM109中，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 h。待長出明顯的單個菌落后，挑取2～3個菌落進行測序，并將測序正確的轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)入B.subtilisWB600中，得到突變菌株。挑取單個菌落至LB培養(yǎng)基(含100 μg/mL卡納霉素)中，于37 ℃、220 r/min搖床振蕩培養(yǎng)8 h。將種子液以2%的接種量轉(zhuǎn)接TB培養(yǎng)基，37 ℃，220 r/min搖床振蕩培養(yǎng)15 h。

表1 E3、 E55、 D213位點飽和突變引物Table 1 Saturation mutagenesis-primer of E3, E55 andD213 site

注： “NNK”、“MNN”中N代表A/G/C/T；K代表G/T；M代表A/C。

1.2.3 YbgJ突變體的純化

將發(fā)酵液于4 ℃，7 000 r/min條件下離心15 min后收集菌體，將菌體用buffer A (pH 7.5，20 mmol/L K2HPO4-KH2PO4緩沖液)重懸后超聲破碎30 min (工作1 s，暫停2 s)，于4 ℃，7 000 r/min條件下離心15 min即得粗酶液。將粗酶液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后使用His TrapTMHP 5 mL(GE)進行純化。首先使用buffer A平衡預(yù)裝柱，以1 mL/min的流速上樣，上樣量15 mL。用10倍柱體積的結(jié)合緩沖液脫洗非特異性結(jié)合雜質(zhì)，隨后用洗脫緩沖液(500 mmol/L咪唑，20 mmol/L K2HPO4-KH2PO4，pH 7.5) 洗脫結(jié)合蛋白，其中15%洗脫緩沖液洗脫出雜蛋白，40%洗脫緩沖液洗脫出目標(biāo)蛋白。收集穿透峰、洗脫峰，利用SDS-PAGE檢測YbgJ突變體純化情況。

1.2.4 YbgJ酶活測定

采用奈氏試劑法[15-16]測定YbgJ的活力。利用buffer A配制底物(L-谷氨酰胺，1.2 g/110 mL)，取1 100 μL底物(74 mmol/L)于37 ℃保溫10 min后，加入100 μL稀釋到適當(dāng)倍數(shù)的粗酶液，37 ℃反應(yīng)10 min后加入100 μL終止劑(三氯乙酸，1.5 mol/L)終止反應(yīng)。在37 ℃保溫10 min的1 100 μL底物中加入上述100 μL粗酶液與100 μL終止劑的混合液，于37 ℃保溫10 min，所得溶液即為吸光度檢測的對照。反應(yīng)結(jié)束后12 000 r/min離心2 min，取100 μL上清，加入3 400 μL去離子水和500 μL奈氏試劑，混勻后在波長436 nm下測定吸光度。酶活力的定義：在37 ℃，pH為7.5條件下每分鐘催化L-谷氨酰胺產(chǎn)生1 μmol NH3所需要的酶量定義為1個酶活力單位。

1.2.5 濃度的測定

蛋白質(zhì)濃度測定采用Bradford蛋白濃度測定試劑盒，具體按說明書操作。

1.2.6 酶學(xué)參數(shù)的測定

半衰期檢測(t1/2, min)：將純化后的突變YbgJ稀釋到同一濃度，放置于55 ℃水浴保溫30 min，其中每隔3 min取樣并按照1.2.4方法測定YbgJ的殘余酶活，確定半衰期。

Km和kcat測定：配制0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 mmol/L的L-谷氨酰胺溶液，按照1.2.4測定酶活力，并用MATLAB軟件擬合y=ax/(b+x)曲線，b=Km、a=Vmax，再計算得到Kcat值、Kcat/Km值。

數(shù)據(jù)分析：采用Microsoft Office Excel 2003單因素方差分析模塊對WT和突變體的酶學(xué)參數(shù)進行分析。

1.2.7 圓二色譜及穩(wěn)態(tài)熒光光譜分析

采用圓二色譜儀(circular dichroism spectrum, CD)分析YbgJ以及突變體YbgJ的二級結(jié)構(gòu)。將純化后的YbgJ酶液稀釋到100～120 μg/mL，樣品池光程為1 mm，分析190～250 nm遠(yuǎn)紫外波長下的CD光譜。再運用在線預(yù)測網(wǎng)站(http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk/html/home.shtml)獲得蛋白質(zhì)的各類二級結(jié)構(gòu)(α螺旋、β折疊等)的含量。

采用Hitatch F-7000測定YbgJ內(nèi)源熒光光譜。將純化后的YbgJ及突變體用buffer A稀釋至100 μg/mL，激發(fā)波長為298 nm，發(fā)射波長為300～500 nm，間隔0.2 nm進行掃描，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為10 nm。

1.2.8 醬油發(fā)酵模擬體系的構(gòu)建

醬油發(fā)酵模型系統(tǒng)(5 mL)由大豆蛋白分離物、NaCl、堿性蛋白酶、復(fù)合風(fēng)味酶、谷氨酰胺酶組成。0.5 g大豆蛋白分離物(SPI)溶于5 mL 100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)中，加入堿性蛋白酶500 μL，60 ℃水浴2 h后加入復(fù)合風(fēng)味500 μL，50 ℃繼續(xù)水浴4 h，90 ℃ 10 min終止蛋白酶的活性。4 ℃，12 000 r/min離心15 min，收集上層樣品用作生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)的底物。根據(jù)FIELDS的方法[17]利用三硝基苯磺酸(TNBS)測定α-氨基含量以檢測大豆蛋白分離物被酶解的程度，使用L-亮氨酸作為標(biāo)準(zhǔn)樣品。在上層清液中加入18% NaCl，調(diào)節(jié)pH至5。將制備得到的YbgJ及突變體純酶液添加到模型反應(yīng)混合物中，45 ℃水浴保溫，在不同的時間取出反應(yīng)液1 mL，90 ℃ 10 min終止酶反應(yīng)。利用谷氨酸脫氫酶檢測谷氨酸的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 YbgJ突變位點的確定

運用Discovery Studio 2017軟件的分子對接模塊，構(gòu)建YbgJ與底物L(fēng)-谷氨酰胺的復(fù)合物。利用該軟件的虛擬氨基酸突變模塊，對YbgJ中具有不利相互作用的49個氨基酸進行丙氨酸掃描，基于突變能變(ΔΔGmut)分析影響該酶熱穩(wěn)定性的關(guān)鍵氨基酸。一般認(rèn)為，ΔΔGmut值是負(fù)值，表明突變后能量下降，酶穩(wěn)定性提高；反之突變后能量上升，酶穩(wěn)定性較差。根據(jù)能量值高低對突變體排序(如圖1-b)，選擇前3個氨基酸位點E3、E55、D213進行飽和突變實驗。

圖1 YbgJ三級結(jié)構(gòu)部分不利相互作用位點(a)及虛擬突變體能量值(b)Fig.1 Part of the adverse interaction sites of YbgJ tertiary structure(a) and energy value of virtual mutant(b)

2.2 YbgJ突變體的構(gòu)建與表達

以pP43NMK-YbgJ質(zhì)粒為模板，通過PCR引入突變氨基酸。將測序正確的轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)入B.subtilisWB600中，發(fā)酵表達YbgJ突變體，測胞內(nèi)YbgJ的熱穩(wěn)定性。前期研究中發(fā)現(xiàn)野生型YbgJ在55 ℃下的半衰期為10.79 min。為了能夠篩選到穩(wěn)定性提高的突變體，本研究將E3、E55、D213位點所有突變體在55 ℃保溫12 min測定殘余酶活(圖2)。

M-蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量(kDa)；1～9-YbgJ、E55F、E55L、D213T、D213W、D213R、E3C、E3S、E3P純酶液圖2 pP43NMK-YbgJ質(zhì)粒圖(a)及優(yōu)勢突變體純化蛋白的電泳分析圖(b)Fig.2 The plasmids mapof pP43NMK-YbgJ(a) and SDS-PAGE analysis(b) of wild YbgJ and mutant enzymes

突變體E55F、D213T、E3C、E3S、E3P和E3A較WT熱穩(wěn)定性明顯提高。通過Ni2+親和層析法純化得到E55F、E55L、D213T、D213W、D213R、E3C、E3S、E3P純酶液(圖2-b)，進一步分析其酶學(xué)性質(zhì)。

2.3 YbgJ突變體酶學(xué)性質(zhì)分析

如表2所示，突變體E3C、E3S、E3P、E55F、D213T半衰期(t1/2，55 ℃)較WT分別提高58%、42%、39%、69%和41%，這表明E3、E55、D213對YbgJ的熱穩(wěn)定性有較大的影響。此外D213W、D57S和D213T的比酶活分別提高了17%、12%和11%，而突變體E55F、E55L、D213R和E3S比酶活反而降低。所有突變體的Km值與WT相比均下降，其中D213T、E55F突變體的Km值分別降低了22%、19%；突變體的催化常數(shù)(kcat)與野生型相比提高了2%～13%不等；突變體E55F、D213T、D57S的kcat/Km分別提高了37%、32%、30%。這說明E55、D213對YbgJ的底物結(jié)合能力有一定的影響。

表2 野生YbgJ和突變體的酶學(xué)性質(zhì)Table 2 Enzymatic properties of WT and mutants

注：P值用于判斷突變體和WT之間酶學(xué)參數(shù)的統(tǒng)計學(xué)顯著性。

2.4 復(fù)合突變提高YbgJ熱穩(wěn)定性

在前面研究中得到E3C、E55F、D213T三株較好的正向突變體。為了進一步驗證E3，E55，D213位點對YbgJ穩(wěn)定性有重要影響，將位點E3、E55、D213進行復(fù)合突變，獲得E3C/E55F、E3C/D213T、E55F/D213T和E3C/E55F/D213T四個突變體(表3)。

如表3所示，4個復(fù)合突變體的半衰期(t1/2，55 ℃)明顯提高，E3C/E55F/D213T、E3C/E55F、E3C/D213T和E55F/D213T的半衰期與WT相比分別提高了1.73、1.44、1.22和0.97。研究表明：多個耐熱性突變位點協(xié)同作用可以進一步提高熱穩(wěn)定性。對復(fù)合突變體動力學(xué)參數(shù)進行分析，發(fā)現(xiàn)復(fù)合突變體Km值與WT相比均下降，其中E3C/D213T下降了31%。此外E3C/E55F/D213T、E3C/E55F的Kcat值提高的幅度較大，分別提高39%和29%。4個復(fù)合突變體比酶活均有增加，其中E55F/E3C提高23%，最終為693 U/mg。

表3 野生YbgJ和復(fù)合突變體的酶學(xué)性質(zhì)Table 3 Enzymatic properties of WT and mutants

注：P值用于判斷突變體和WT之間酶學(xué)參數(shù)的統(tǒng)計學(xué)顯著性。

2.5 YbgJ突變體的穩(wěn)定化機制分析

上述研究中發(fā)現(xiàn)E3C/E55F/D213T 穩(wěn)定性較好，為進一步分析突變體穩(wěn)定性提升的原因，本研究利用圓二色譜(CD)和熒光光譜對WT及其突變體的二級、三級結(jié)構(gòu)進行分析比較(圖4)。如圖4-a所示，突變體的CD圓二色譜曲線無明顯變化，說明其二級結(jié)構(gòu)并未發(fā)生改變。為進一步定量WT及突變體的二級結(jié)構(gòu)含量，利用在線軟件分析各二級結(jié)構(gòu)的含量，結(jié)果顯示突變體與WT的二級結(jié)構(gòu)含量沒有顯著區(qū)別。如圖4-b所示，熒光光譜結(jié)果顯示其最大熒光吸收峰沒有發(fā)生變化，仍為394 nm。綜合上述結(jié)果可知復(fù)合突變并未改變YbgJ的結(jié)構(gòu)。

□-WT；▲-E3C/E55F/D213T圖4 野生型及其突變體圓二色譜(a)及穩(wěn)態(tài)熒光光譜分析(b)Fig.4 CD spectrum(a) and steady-state fluorescence spectra analysis(b) of WT and its mutants

為深入分析YbgJ突變體穩(wěn)定性提高的機理，利用DS服務(wù)器以YbgJ (1mki.PDB)為模板同源建模，構(gòu)建突變體的三維結(jié)構(gòu)模型，并結(jié)合在線軟件Protein Interaction calculator (http://pic.mbu.iisc.ernet.in/job.html)分析WT及突變體分子內(nèi)部的相互作用力(如表4)。有研究表明，蛋白質(zhì)分子的熱穩(wěn)定性、催化活性與蛋白質(zhì)分子間作用力的種類和數(shù)量有關(guān)，且降低蛋白表面的疏水性或者增強分子內(nèi)部的疏水性有利于蛋白質(zhì)的穩(wěn)定。PACE等[18]為了更好地了解蛋白質(zhì)分子間相互作用對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的貢獻，測定了四種蛋白突變體的構(gòu)象穩(wěn)定性的變化，研究發(fā)現(xiàn)疏水相互作用對小蛋白穩(wěn)定性的貢獻小于大蛋白質(zhì)；折疊中掩埋的-CH2基團對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性貢獻(1.1±0.5) kcal/mol；疏水相互作用貢獻(60±4)%，氫鍵貢獻(40±4)%；構(gòu)象熵貢獻約2.4 kcal/mol/殘基，并且提出蛋白質(zhì)的球狀構(gòu)象主要由疏水性相互作用穩(wěn)定。如表4所示，突變體E3C/E55F/D213T、E3C/E55F和E55F/D213T 的疏水相互作用力都增加。因此疏水作用力的增加極有可能是YbgJ熱穩(wěn)定性提高的一個原因。

此外，突變體E3C/E55F/D213T、E3C/E55F、E3C/D213T和E55F/D213T 較WT分別增加了30、23、11和8個氫鍵。JOHN等[19]為了研究來自極端嗜熱生物Thermusaquaticus的D-甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)熱穩(wěn)定性的決定因素，將各種來源的GAPDH進行比較，發(fā)現(xiàn)熱穩(wěn)定性與帶電側(cè)鏈和中性配位體間的氫鍵數(shù)量存在很強的相關(guān)性。MABROUK等[20]基于序列比對和同源建模改造了芽孢桿菌屬的麥芽糖淀粉酶，發(fā)現(xiàn)酶熱穩(wěn)定性提高是因為形成了新的疏水相互作用、鹽橋和氫鍵，同時也提出氫鍵增加是酶分子穩(wěn)定性提高的重要原因之一。因此氫鍵的增加可能是YbgJ熱穩(wěn)定性提高的重要原因之一。

表4 突變前后YbgJ作用力變化Table 4 Interactions potentially involved in the stability of wild-type and mutant

運用軟件DS對YbgJ和突變體的不利相互作用數(shù)量進行統(tǒng)計(如表4)。突變體E3C/E55F/D213T、E3C/E55F、E3C/D213T和E55F/D213T較WT分別減少了5、4、4、3不利相互作用。相關(guān)研究表明蛋白質(zhì)表面相同電荷之間的排斥相互作用會使蛋白質(zhì)穩(wěn)定性降低[13]。由此推測，不利相互作用的減少也可能是YbgJ熱穩(wěn)定性提高的原因之一。

2.6 醬油發(fā)酵模型反應(yīng)中YbgJ及突變體的應(yīng)用

為了驗證YbgJ及突變體的潛在應(yīng)用價值，將純酶液添加到醬油發(fā)酵模型反應(yīng)中檢測谷氨酸的產(chǎn)量。利用堿性蛋白酶和復(fù)合風(fēng)味酶對大豆蛋白進行酶解，檢測酶解液中的α-氨基含量達到97～100 mmol/L，表明大豆蛋白被降解。在上層清液中加入18% NaCl，調(diào)節(jié)pH至5，模擬醬油發(fā)酵反應(yīng)。將制備得到的YbgJ及突變體純酶液添加到反應(yīng)混合物中，45 ℃水浴保溫。利用谷氨酸脫氫酶測不同時間谷氨酸的含量。如圖5所示，相比于添加YbgJ的醬油發(fā)酵模型體系，添加復(fù)合突變體有效地增加了谷氨酸的含量。

■-WT；▽-E55F / D213T；▲-E3C/D213T；□-E3C/E55F；△-E3C/E55F/D213T圖5 醬油發(fā)酵模型中谷氨酸的產(chǎn)量Fig.5 Glutamic acid production in soy sauce fermentation model

在pH為5的醬油發(fā)酵模型中，添加E3C/E55F/D213T、E3C/E55F、E3C/D213T、E55F/D213T后谷氨酸的含量分別比添加WT提高134%、86%、60%、42%。隨著反應(yīng)時間的延長，谷氨酰胺酶逐漸失活，谷氨酸含量的增長逐漸減慢。比較圖中5條曲線，發(fā)現(xiàn)E3C/E55F/D213T在5～10 h中的谷氨酸增長斜率>E3C/E55F>E3C/D213T>E55F/D213T>WT，由此說明E3C/E55F/D213T的應(yīng)用價值較大。

3 結(jié)論

本研究中通過飽和突變的方法，確定了E3、E55、D213位點是提高谷氨酰胺酶熱穩(wěn)定性的重要位點，構(gòu)建的突變體E3C、E55F、D213T半衰期(t1/2，55 ℃)較WT分別提高58%、69%和41%。復(fù)合突變體E3C/E55F/D213T、E3C/E55F、E3C/D213T和E55F/D213T的半衰期(t1/2，55 ℃)與WT相比分別提高了1.73、1.44、1.22和0.97，其中E3C/E55F比酶活提高23%，最終為693 U/mg。在pH為5的醬油發(fā)酵模型中，添加E3C/E55F/D213T、E3C/E55F、E3C/D213T、E55F/D213T后谷氨酸的含量分別比添加WT提高134%、86%、60%、42%。獲得的熱穩(wěn)定性提高及催化活性提高的突變體YbgJ將有助于工業(yè)化應(yīng)用。