陳 莉，趙健紅，張霽雯

上海市寶山區(qū)羅店醫(yī)院檢驗(yàn)科(上海201908 )

近年來，隨著生活水平和飲食結(jié)構(gòu)的改變，老齡化及肥胖率的增加，糖尿病的患病人數(shù)快速增加，已成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。據(jù)調(diào)查顯示，2015年世界成人患病率為8.8%[1]，而我國糖尿病患病率已經(jīng)高達(dá)12.6%[2]。糖尿病發(fā)病機(jī)制尤為復(fù)雜，是由多基因遺傳和環(huán)境因素引起的，一旦確診，需終身治療,同時糖尿病會誘發(fā)各種心腦血管疾病的發(fā)生[3]。環(huán)境因素中飲食結(jié)構(gòu)的改變和體力活動減少而引起的肥胖在糖尿病的發(fā)病中起到重要作用，飲食控制對肥胖及糖尿病患者來說是最經(jīng)濟(jì)、最有效的控制手段之一[4]。飲食控制的主要是能量的限制，即熱量限制(Calorie restriction，CR)。熱量限制不僅可以預(yù)防多種遲發(fā)性疾病，延緩衰老，延長壽命[5]，而且在糖尿病等心血管疾病中發(fā)揮重要作用[6]。研究表明氧化應(yīng)激是發(fā)生糖尿病等心血管疾病的主要機(jī)制之一，氧化應(yīng)激是誘發(fā)糖尿病的發(fā)生因素之一[7]，而氧化應(yīng)激與血脂異常在糖尿病微血管病變中也具有重要作用[8]。本研究利用糖尿病模型Kkay小鼠，探究熱量限制對Kkay小鼠炎性因子和血脂代謝的影響，為熱量限制控制糖尿病提供理論依據(jù)。

材料與方法

1 動物來源 從北京華阜康生物科技有限公司購買16只8周Kkay小鼠作為試驗(yàn)組，體重為35～45 g,另購買8周C57BL/6J小鼠8只，體重為25～35 g。維持12 h光照和12 h黑暗的晝夜節(jié)律。實(shí)驗(yàn)室溫度: 20～25 ℃，濕度：(50±5)%，自由飲水。Kkay小鼠喂養(yǎng)kkay專用飼料(北京華阜康生物科技有限公司)，C57BL/6J喂養(yǎng)普通飼料，干預(yù)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，自由飲食。

2 實(shí)驗(yàn)儀器 血糖儀與血糖試紙購自美國羅氏公司；動物血清甘油三酯(TG)、膽固醇(TCH)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)及高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)血脂檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究有限公司；超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD) 、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px) 試劑盒購于南京建成生物工程研究所有限公司。

3 動物分組與處理 將16只Kkay小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表的方法隨機(jī)分為kkay對照組(kkay組，n=8只)，熱量限制組(CR組，n=8只)；另外8只C57小鼠作為常規(guī)對照(C57組，n=8只)；kkay組與C57組小鼠給予自由飲食，每天記錄下小鼠飲食攝入量，CR組飲食攝入量為kkay組小鼠攝入量的60%[7]，干預(yù)持續(xù)12周，每隔4周測各組小鼠的血糖、體重，于干預(yù)前，干預(yù)后第4周、8周及12周各測一組。

4 血清的采集與處理 各組大鼠干預(yù)12周后，大鼠腹腔注射麻藥(2%戊巴比妥45 mg/kg),下腔靜脈取血，3000 r/min離心10 min，取上清-20 ℃保存待用。血脂檢測采用生化試劑盒，WST-1 法測定血清中SOD 活性; 過氧化物酶微量測定法檢測血清中GSH-Px 的含量。

結(jié)果

1 熱量限制對Kkay小鼠血糖的影響 干預(yù)前，兩組Kkay小鼠血糖為(10.34±0.85) mmol/L，對照C57組小鼠血糖為(6.62±0.63) mmol/L，Kkay小鼠血糖與C57小鼠血糖差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)；由表1發(fā)現(xiàn)C57組與kkay組干預(yù)前至干預(yù)第12周期間，血糖均趨于穩(wěn)定，而對Kkay小鼠熱量限制后，干預(yù)CR組血糖隨著干預(yù)時間的延長，血糖逐漸下降，干預(yù)至第8周后，CR組Kkay小鼠血糖顯著低干預(yù)水平(P=0.03)，同時較kkay組血糖仍顯著下降(P<0.001)，趨于正常對照C57水平，但仍與C57血糖水平差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。

表1 熱量限制對Kkay小鼠血糖的影響(mmol/L)

注：與C57組相比，*P<0.05；與kkay組相比，△P<0.05；各干預(yù)組中，與干預(yù)前相比，#P<0.05

2 熱量限制對Kkay小鼠體重的影響 干預(yù)前兩組Kkay小鼠體重為(39.87±4.62)g，顯著高于正常對照C57組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)；正常對照C57組小鼠和kkay組小鼠隨著干預(yù)時間的增加，體重逐漸增加，而干預(yù)CR組體重較為穩(wěn)定，并有略微下降，干預(yù)至第12周，CR組小鼠體重低于kkay組(P<0.001)。見表2。

表2 熱量限制對Kkay小鼠體重的影響(g)

注：與C57組相比，*P<0.05；與kkay組相比，△P<0.05；各干預(yù)組中，與干預(yù)前相比，#P<0.05

3 熱量限制對Kkay小鼠血脂代謝的影響 由表3可以看出，干預(yù)12周后，kkay組小鼠血清TCH、TG及LDL-C水平顯著高于C57組，熱量限制后，CR組血清TCH、TG及LDL-C水平顯著降低(P<0.05)，其中血清TG水平降為正常對照C57組水平，TCH與LDL水平仍與正常對照C57組有一定的差異(P<0.05)；而kkay組小鼠血清HDL-C水平顯著低于C57組，對Kkay小鼠給予熱量限制后，其血清HDL-C與Kkay小鼠差異無統(tǒng)計學(xué)意義，仍低于C57組。

表3 熱量限制對Kkay小鼠血脂代謝的影響(mmol/L)

注：*表示與C57組相比，P<0.05；△表示與kkay組相比，P<0.05

4 熱量限制對Kkay小鼠氧化應(yīng)激的影響 由表4可以看出，kkay組小鼠血清中SOD水平和GSH-Px水平顯著低于C57組，而給予12周的熱量限制后，CR組Kkay小鼠血清SOD和GSH-Px水平顯著改善(P<0.05)，但仍與C57組小鼠血清炎性因子有一定的差異(P<0.05)。

表4 熱量限制對Kkay小鼠氧化應(yīng)激的影響

討論

2型糖尿病是一組以胰島素抵抗和胰島素分泌減少的為特征，以高血糖為表現(xiàn)形式的慢性代謝性疾病[9]。糖尿病會誘發(fā)各種心腦血管疾病的發(fā)生，是導(dǎo)致糖尿病患者死亡的主要原因[10]。大量的氧化應(yīng)激會刺激應(yīng)激敏感信號系統(tǒng)，破壞胰島β細(xì)胞功能，胰島素分泌減少，最終導(dǎo)致胰島β細(xì)胞凋亡及胰島素抵抗，增加葡萄糖的耐受，進(jìn)而誘發(fā)2型糖尿病[11]。另外氧化應(yīng)激微血管病變中也具有重要作用，大量的活性氧可直接導(dǎo)致大量心肌細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致心力衰竭[12]

糖尿病模型Kkay小鼠是國內(nèi)外較為常用的自發(fā)性糖尿病模型[13]。此小鼠攜帶有肥胖的易感基因，在高脂飼料誘導(dǎo)下，喂養(yǎng)4周后小鼠即出現(xiàn)肥胖，高血糖，胰島素抵抗，高脂血癥，發(fā)病機(jī)制是高脂肪飲食的攝入[14]，因此其能更好的模擬糖尿病是有遺傳因素和環(huán)境因素相互作用引起的。本研究可以發(fā)現(xiàn)Kkay小鼠體重和血糖顯著高于對照C57組，同時Kkay小鼠長期處于較高的氧化應(yīng)激狀態(tài)， kkay組小鼠血清TCH、TG及LDL-C水平顯著高于C57組，出現(xiàn)顯著脂質(zhì)代謝紊亂。

發(fā)達(dá)國家往往由于其食物以高脂肪高蛋白的食物為主，其糖尿病的患病率較高，而過去以淀粉為主食的包括我國在內(nèi)東亞國家脂肪和蛋白質(zhì)的攝入量增加，糖尿病的患病率也增加，其飲食結(jié)構(gòu)的改變主要體現(xiàn)在高熱量飲食[15]。飲食控制對肥胖及糖尿病患者來說是最經(jīng)濟(jì)、最有效的控制手段之一。飲食控制的主要是能量的限制，即熱量限制(CR)。熱量限制是指減少20%～40%日常所需攝入的能量，而保證必須營養(yǎng)素的攝入，保證正常的生理功能[16]。熱量限制不僅可以預(yù)防多種遲發(fā)性疾病，延緩衰老，延長壽命[17]，而且在糖尿病等心血管疾病中發(fā)揮重要作用。Gao等研究發(fā)現(xiàn)，對高脂喂養(yǎng)的C57給予40%的熱量限制，可以減輕肥胖小鼠的體重，恢復(fù)小鼠的糖耐量，提高機(jī)體對胰島素的敏感性，延緩向糖尿病的轉(zhuǎn)歸[18]。Lean對157例糖尿病患者給予度低熱量飲食，干預(yù)3-5個月，之后隨訪12個月發(fā)現(xiàn)高達(dá)46%的患者糖尿病癥狀完全緩解，不需要藥物就可控制良好[19]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，對Kkay小鼠熱量限制后，其體重和血糖顯著降低；CR組血清TCH、TG及LDL-C水平顯著降低，Kkay小鼠血清SOD和GSH-Px水平升高，小鼠的氧化應(yīng)激和脂質(zhì)代謝發(fā)生顯著改善。這與Ishida等研究相似，其機(jī)制可能是熱量限制通過氧化應(yīng)激等途徑使β細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)具有可逆性，β 細(xì)胞去分化顯著降低。改善胰島β細(xì)胞功能[20]。因此我們認(rèn)為熱量限制可以改善糖尿病小鼠氧化應(yīng)激和血脂代謝，為糖尿病的治療提供新的思路。