馬 超，郭萬(wàn)剛，馬文帥

空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院心血管內(nèi)科(西安 710038)

多柔比星(Doxorubicin，DOX)是蒽環(huán)類(lèi)抗腫瘤藥物的成員之一，具有強(qiáng)效抗腫瘤作用。它廣泛用于治療乳腺癌、白血病、淋巴瘤、肉瘤和其他類(lèi)型的癌癥[1-2]。多柔比星最主要的副作用是心臟毒性，多柔比星累積劑量為550 mg/m2時(shí)心臟毒性發(fā)生率為7%，累積劑量為700 mg/m2時(shí)發(fā)生率為18%[3]。充分證據(jù)顯示，多柔比星可明顯增加心肌細(xì)胞自由基產(chǎn)量，損害細(xì)胞抗氧化酶活性，進(jìn)而引起細(xì)胞損傷[4]。

葛根素(8-β-D-葡萄吡喃糖-4',7-二羥基異黃酮)，是從葛根中提取的一種糖苷化合物[5]。它是一種在中國(guó)、日本、韓國(guó)和東南亞等國(guó)家和地區(qū)廣泛用于治療心絞痛、心肌梗死和其他心臟癥狀的傳統(tǒng)中草藥[6]。以前的研究表明，葛根素可以增加冠狀動(dòng)脈血流量，降低心肌耗氧量并可以減輕心血管疾病患者和動(dòng)物的心肌缺血再灌注損傷[7]。然而，關(guān)于葛根素對(duì)多柔比星引起的心臟毒性的研究很少且機(jī)制尚未完全闡明。

以往研究證實(shí)，葛根素具有強(qiáng)烈的抗氧化活性，并可通過(guò)抑制氧化應(yīng)激損傷緩解腎損傷[8]、肝損傷[9]、心肌缺血再灌注損傷[10]等多種疾病。此外，最新研究表明，葛根素具有潛在的抗凋亡作用[11]。因此，我們假設(shè)葛根素可通過(guò)減少心肌細(xì)胞凋亡和(或)氧化應(yīng)激損傷來(lái)緩解多柔比星引起的急性心肌損傷。此外，葛根素發(fā)揮心肌保護(hù)作用的具體分子信號(hào)機(jī)制也需進(jìn)一步探究。

材料和方法

1 主要試劑和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 葛根素(Sigma公司)；DOX(Cayman公司)；抗β-actin抗體(CST公司)；抗SIRT3、Ac-SOD2抗體(Abcam公司)；抗SOD2抗體(Santa-Cruz公司)；羊抗兔、羊抗鼠二抗(北京中杉金橋公司)；DHE染料(Invitrogen公司)；乳酸脫氫酶(LDH)和丙二醛(MDA)含量檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。雄性C57小鼠，體重22～25 g，8周齡，由空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

2 研究方法

2.1 動(dòng)物模型的建立:如前所述[12]，單次腹腔注射多柔比星(15 mg/kg，溶于生理鹽水)以誘導(dǎo)小鼠急性心臟毒性。對(duì)照組小鼠腹腔注射等容量生理鹽水(0.2 ml)。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組及給藥方式:將90只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為六組，每組15只，即正常組(Control組)、單純葛根素處理組(Pue組)、多柔比星處理組(DOX組)、多柔比星+葛根素處理組(DOX+Pue組)、3-TYP+多柔比星+葛根素(3-TYP+DOX+Pue)組；3-TYP+多柔比星(3-TYP+DOX)組。通過(guò)腹腔注射葛根素，給藥劑量為10 mg/(kg·d)，給藥5 d。SIRT3選擇性抑制劑3-TYP(50 mg/kg，溶解于生理鹽水)在多柔比星給藥前3 d每日腹腔注射1次，共3次。

2.3 在體心臟血流動(dòng)力檢測(cè):多柔比星處理5 d后，剔除小鼠頸前毛發(fā)。通過(guò)右頸總動(dòng)脈插管檢測(cè)等容收縮期左心室內(nèi)壓力上升的最大速率(The maximum rate of upward pressure in the left ventricle，+dp/dt)和等容舒張期左心室壓力下降的最大速率(The maximum rate of left ventricular pressure drop，-dp/dt)，具體操作方法參考以往文獻(xiàn)[12]。

2.4 心肌組織凋亡檢測(cè)和HE染色:多柔比星處理5 d后，取心臟，并將心臟置于10%福爾馬林中固定24 h。制備石蠟塊并切成5 μm的厚度；如以往文獻(xiàn)所述方法[13]，用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP 缺口末端標(biāo)記測(cè)定(TUNEL)試劑盒(Roche Molecular Biochemicals公司，德國(guó))測(cè)量心肌細(xì)胞凋亡情況。細(xì)胞凋亡指數(shù)表示為凋亡細(xì)胞核數(shù)/計(jì)數(shù)的細(xì)胞核總數(shù)×100%。此外，將5 μm厚的心臟組織切片進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色以觀察心臟病理改變。

2.5 心肌組織蛋白表達(dá)測(cè)定:多柔比星處理5 d后，腹腔注射氯胺酮(85 mg/kg)和木聚糖(12.5 mg/kg)，再將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物安樂(lè)死。打開(kāi)胸腔，取出心臟。用生理鹽水洗滌心臟以除去殘留的血液，將心臟組織用液氮冷凍，隨后在-80 ℃冰箱中儲(chǔ)存。將冷凍的組織解凍并使用勻漿器在PBS緩沖液(pH 7.4)中勻漿。將上清液分成2～3份，置于分開(kāi)的管中，并再次儲(chǔ)存在-80 ℃。用BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)各組樣品蛋白濃度。用10%Bis/Tris凝膠分離各組樣本蛋白，并用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉1 h，室溫下孵育抗SIRT3(1∶1000)、Ac-SOD2(1∶1000)、SOD2(1∶500)和β-actin(1∶1000)抗體2 h；TBST洗滌3次；室溫孵育羊抗兔、羊抗鼠二抗(1∶5000)2 h；用TBST洗滌3次。使用BioRad成像系統(tǒng)檢測(cè)條帶并進(jìn)行蛋白半定量分析。

2.6 心肌組織氧化應(yīng)激水平測(cè)定:多柔比星處理5 d后，將液氮冰凍的心臟組織切成10 μm厚度的冰凍切片，按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行DHE染色，熒光顯微鏡拍照并用Image Pro-Plus軟件進(jìn)行熒光強(qiáng)度分析。此外，將冰凍的心肌組織化凍后以心肌組織(g)和生理鹽水(ml)1∶9的比例制作組織勻漿。按照MDA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)襲擊組織內(nèi)MDA含量。

結(jié)果

1 葛根素處理改善多柔比星引起的急性心臟毒性

心肌細(xì)胞空泡變性是DOX誘導(dǎo)的心臟毒性中心肌細(xì)胞損傷的重要標(biāo)志。Control組小鼠心肌細(xì)胞幾乎沒(méi)有檢測(cè)到空泡變性，而DOX處理組小鼠空泡變性明顯增加。與DOX組相比，葛根素處理可以明顯抑制小鼠心肌細(xì)胞空泡變性。與Control組相比，單純給予葛根素不會(huì)引起心肌細(xì)胞發(fā)生空泡變性(圖1A)。此外，我們使用LDH檢測(cè)試劑盒通過(guò)反射光譜法檢測(cè)了各組小鼠血清LDH活性。結(jié)果顯示，與Control組小鼠相比，DOX組小鼠血清內(nèi)LDH(心肌損傷的重要血清標(biāo)志物)活性顯著上升，而給予葛根素處理可以明顯降低LDH活性(P<0.01，圖1B)。小鼠多柔比星給藥5 d后檢測(cè)各組小鼠心臟收縮和舒張功能。如圖1C-D所示，與Control組小鼠相比，DOX組小鼠心臟收縮和舒張功能明顯受損，表現(xiàn)為+dp/dt與-dp/dt明顯降低(P<0.01)。與DOX組相比，葛根素處理后能明顯提高+dp/dt與-dp/dt(P< 0.01)。與Control小鼠相比，單純給予葛根素對(duì)小鼠心臟收縮和舒張功能無(wú)明顯影響(P>0.05)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明葛根素可有效緩解DOX誘導(dǎo)的急性心臟毒性。

2 葛根素處理抑制多柔比星引起的心肌氧化應(yīng)激損傷 小鼠腹腔注射多柔比星5 d后檢測(cè)各組小鼠心肌組織內(nèi)ROS產(chǎn)量。結(jié)果顯示，與Control組小鼠相比，DOX組小鼠心肌組織內(nèi)ROS產(chǎn)量明顯增加，而葛根素處理可以明顯降低ROS產(chǎn)量(P<0.01)。與Control組小鼠相比，單純給予葛根素處理對(duì)心肌組織ROS產(chǎn)量無(wú)明顯影響(P>0.05)。此外，DOX也可明顯增加心肌組織內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA含量，而葛根素可以明顯降低MDA含量(P<0.01)。與Control組小鼠相比，單純給予葛根素對(duì)心肌組織MDA含量無(wú)明顯影響(P>0.05,圖1E-F)。

3 葛根素處理抑制多柔比星引起的心肌凋亡 小鼠腹腔注射多柔比星5 d后檢測(cè)各組小鼠心肌細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示，與Control組小鼠相比，DOX組小鼠心肌細(xì)胞凋亡率明顯增加，而葛根素處理可以明顯降低心肌細(xì)胞凋亡率(P<0.01)。與Control組小鼠相比，單純給予葛根素處理對(duì)心肌細(xì)胞凋亡率無(wú)明顯影響(P>0.05,圖1G-H)。

A：各組小鼠左室心肌HE染色圖(400×)；B：血清乳酸脫氫酶(LDH)水平；C：等容收縮期左心室內(nèi)壓力上升的最大速率(+dp/dt)；D：等容舒張期左心室壓力下降的最大速率(-dp/dt)；E：活性氧(ROS)產(chǎn)量；F：丙二醛(MDA)含量；G：TUNEL染色(400×)，標(biāo)尺為100 μm；H：凋亡率。**P< 0.01，與DOX組相比,△△P<0.01

圖1 葛根素處理對(duì)多柔比星急性心臟毒性的影響(n=6)

4 葛根素處理可激活多柔比星處理后心肌組織內(nèi)SIRT3/SOD2信號(hào)通路 小鼠腹腔注射多柔比星5 d后檢測(cè)各組小鼠心肌組織內(nèi)SIRT3/SOD2信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況。我們發(fā)現(xiàn)，與Control小鼠相比，DOX組小鼠心肌組織中SIRT3的表達(dá)量明顯下降，而Ac-SOD2的表達(dá)量明顯增高(P<0.01)。與DOX組相比，葛根素處理可以明顯提高心肌組織內(nèi)SIRT3的表達(dá)，降低Ac-SOD2的表達(dá)(P<0.01)。與Control相比，單純給予葛根素處理對(duì)SIRT3和Ac-SOD2蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯影響(圖2，P>0.05)。

A：Western blot條帶；B：SIRT3表達(dá)水平；C：SOD2乙?；健ＥcControl相比，**P<0.01;與DOX組相比,△△P<0.01

5 阻斷SIRT3/SOD2信號(hào)通路逆轉(zhuǎn)葛根素對(duì)多柔比星心臟毒性的保護(hù)作用 為了驗(yàn)證SIRT3/SOD2信號(hào)通路是否介導(dǎo)葛根素對(duì)多柔比星心臟毒性的保護(hù)作用，我們通過(guò)3-TYP特異性地抑制SIRT3的活性。與DOX+Pue組相比，3-TYP處理可以明顯增加心肌細(xì)胞空泡變性程度，增加血清內(nèi)LDH活性，惡化小鼠心臟收縮和舒張功能，增加心肌組織內(nèi)ROS產(chǎn)量和MDA含量，增加心肌組織凋亡率(P均<0.05)。與DOX組相比，單純給予3-TYP對(duì)DOX處理后心肌組織的上述指標(biāo)無(wú)明顯影響(P> 0.05)。見(jiàn)圖3。

A：各組小鼠左室心肌HE染色圖(400×)；B：血清乳酸脫氫酶(LDH)水平；C：等容收縮期左心室內(nèi)壓力上升的最大速率(+dp/dt)；D：等容舒張期左心室壓力下降的最大速率(-dp/dt)；E：活性氧(ROS)產(chǎn)量；F：丙二醛(MDA)含量；G：TUNEL染色(400×)，標(biāo)尺為100 μm；H：凋亡率。與DOX組相比，△/△△P<0.05/0.01，與DOX+Pue組相比,#/##P<0.05/0.01。

圖3 抑制SIRT3/SOD2信號(hào)通路對(duì)葛根素心肌保護(hù)作用的影響(n=6)

討論

多柔比星目前仍是臨床上廣泛使用的一種強(qiáng)效廣譜化療劑，可用于治療多種癌癥[1-2]。然而，許多副作用限制了它的臨床療效。心臟毒性是多柔比星的主要副作用，這種現(xiàn)象在臨床患者和動(dòng)物研究中均已被證實(shí)[3, 14]。探尋有效的心臟保護(hù)劑緩解多柔比星誘導(dǎo)的心臟毒性對(duì)于改善腫瘤患者預(yù)后有重要的臨床意義。

葛根素是從葛根中提取的一種糖苷化合物[5]。充分研究證實(shí)，葛根素具有明顯的心肌保護(hù)作用。李靜等[15]證實(shí)，葛根素可以顯著改善冠心病穩(wěn)定型心絞痛患者臨床癥狀和心電圖表現(xiàn)，延緩動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程。行海艦[16]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，葛根素聯(lián)合左卡尼汀可有效降低小兒病毒性心肌炎患者心肌酶水平，改善患者預(yù)后。Shao等[17]發(fā)現(xiàn)，葛根素對(duì)于膿毒癥引起的心臟損傷也發(fā)揮了重要的保護(hù)作用，其作用的發(fā)揮與抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)。Liu等[18]證實(shí)，葛根素可改善嚴(yán)重?zé)齻鸬男募p害。此外，以往研究證實(shí)，葛根素能夠改善多柔比星引起的心臟毒性[19]，但具體機(jī)制尚未完全闡明。值得注意的是，葛根素在多種疾病中都發(fā)揮了抗氧化應(yīng)激和抗凋亡的作用。Wang等[20]證實(shí)，葛根素能夠明顯減輕創(chuàng)傷性腦損傷誘發(fā)的氧化應(yīng)激損傷。Li等[21]發(fā)現(xiàn)，葛根素能夠抑制糖尿病大鼠血管組織氧化應(yīng)激損傷進(jìn)而改善糖尿病引起的主動(dòng)脈損傷。Zhou 等[8]證實(shí)，葛根素通過(guò)抑制氧化應(yīng)激進(jìn)而減輕內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，最終改善單側(cè)輸尿管梗阻引起的腎臟纖維化反應(yīng)。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)，多柔比星處理后小鼠心肌組織內(nèi)ROS產(chǎn)量和MDA含量明顯增高，伴隨心肌凋亡率明顯上升。葛根素處理可以有效抑制多柔比星引起的氧化應(yīng)激損傷和凋亡。綜上，葛根素發(fā)揮抗多柔比星心臟毒性心肌保護(hù)作用與其抗氧化和抗凋亡活性密切相關(guān)。

Sirtuin是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依賴(lài)的組蛋白去乙?；讣易?，從細(xì)菌到人類(lèi)均高度保守，共有SIRT1-7七個(gè)成員[22]。沉默信息調(diào)控因子3(Silent information regulator 3，SIRT3)是線粒體內(nèi)最主要的去乙?；福┠陙?lái)，越來(lái)越多證據(jù)顯示，SIRT3是機(jī)體重要的內(nèi)源性心肌保護(hù)分子。下調(diào)SIRT3表達(dá)可導(dǎo)致心肌細(xì)胞和成人心臟對(duì)缺血再灌注損傷的敏感性增加，并可能加劇老年心臟的心肌缺血再灌注損傷[23- 24]。Zhai等[25]發(fā)現(xiàn)，褪黑素可以通過(guò)激活SIRT3改善心肌缺血再灌注損傷。Guo等[26]證實(shí)，Angiotensin-(1-7)可以通過(guò)激活SIRT3逆轉(zhuǎn)血管緊張素II引起的心肌肥厚。特別值得注意的是，最新證據(jù)顯示，激活SIRT3可明顯緩解由多柔比星引起的心臟毒性[27]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)，多柔比星處理可以明顯下調(diào)心肌組織中SIRT3的表達(dá)，進(jìn)而上調(diào)SOD2的乙?；健６鸶靥幚砜梢悦黠@上調(diào)SIRT3的表達(dá)，下調(diào)SOD2的乙?；健Ｖ档米⒁獾氖?，SIRT3也是機(jī)體內(nèi)抵抗氧化應(yīng)激損傷和凋亡的重要分子。研究發(fā)現(xiàn)，SIRT3是調(diào)節(jié)線粒體谷胱甘肽抗氧化防御系統(tǒng)的重要分子，可以延緩氧化應(yīng)激引起的聽(tīng)覺(jué)喪失[28]。激活SIRT3能夠減輕缺血再灌注引起的心肌細(xì)胞凋亡[25]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)，抑制SIRT3信號(hào)通路可以明顯減弱葛根素的心肌保護(hù)作用，具體體現(xiàn)在3-TYP處理可以明顯增加多柔比星處理后心肌細(xì)胞空泡變性程度，增加血清內(nèi)LDH活性，損害小鼠心臟收縮和舒張功能，增加心肌組織內(nèi)ROS產(chǎn)量和MDA含量，增加心肌組織凋亡率。

綜上所述，我們的研究首次證實(shí)葛根素處理能夠明顯改善多柔比星引起的心臟毒性，其具體作用機(jī)制為激活SIRT3/SOD2信號(hào)通路進(jìn)而抑制氧化應(yīng)激損傷和心肌凋亡。我們的研究為臨床上應(yīng)用葛根素治療多柔比星心臟毒性提供了新的理論依據(jù)。