李 婷 王紅玲 劉 適 王愛平

海南省三亞市人民醫(yī)院消化內(nèi)科1(572000) 武漢大學中南醫(yī)院消化內(nèi)科2

背景：艱難梭菌是院內(nèi)感染的常見原因，在炎癥性腸病(IBD)中的感染率較高，而白細胞介素-8(IL-8)在艱難梭菌的炎癥反應中起有重要作用。目的：探討IL-8-251位點A/T基因多態(tài)性與艱難梭菌感染之間的關(guān)系。方法：選取2011年12月—2013年1月武漢大學中南醫(yī)院就診的173例IBD患者、76例腸易激綜合征患者，以90名正常人群作為對照組。以聚合酶鏈反應(PCR)法檢測糞便中艱難梭菌感染情況，Sanger測序法測定IL-8-251位點A/T基因多態(tài)性，并分析艱難梭菌感染與IL-8-251位點A/T基因多態(tài)性的關(guān)系。結(jié)果：共檢出艱難梭菌陽性者31例(9.1%)。艱難梭菌陽性患者IL-8-251位點AA基因型比例顯著高于艱難梭菌陰性患者(χ2=96.671 8，P<0.000 1)。結(jié)論：IL-8-251位點AA基因型可能是艱難梭菌感染的危險因素，可增加感染艱難梭菌的機會。

艱難梭菌(Clostridiumdifficile)是一種革蘭陽性、專性厭氧的粗大桿菌，有鞭毛，可形成芽孢。艱難梭菌毒素A(腸毒素)、艱難梭菌毒素B(細胞毒素)是其主要的致病毒素，分別由基因tcdA、tcdB編碼，兩者存在協(xié)同作用，可共同導致艱難梭菌相關(guān)性腹瀉(Clostridiumdifficile-associated diarrhea, CDAD)的發(fā)生，并可使CDAD進一步演變?yōu)閭文ば阅c炎。但近年有研究報道了tcdB陽性而tcdA陰性的艱難梭菌[1-2]，引起了人們對tcdB的重視。據(jù)美國一項調(diào)查研究顯示，20%的醫(yī)院內(nèi)腹瀉由艱難梭菌感染引起[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，艱難梭菌在炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)患者中有較高的感染率[4]。近年有報道發(fā)現(xiàn)，部分急性胃腸道感染者治愈后出現(xiàn)了腸易激綜合征(irritable bowel syndrome, IBS)的癥狀，并提出了感染后IBS的概念[5]。白細胞介素-8(interleukin-8， IL-8)是一種炎癥性細胞因子，屬于趨化因子超家族，可強有力地使中性粒細胞趨化，在艱難梭菌感染的炎癥反應中起重要作用。有研究表明，IBD患者糞便中IL-8表達水平顯著增加，IL-8可趨化中性粒細胞游走并集合至炎癥部位，加重IBD患者的病情。IL-8啟動子區(qū)序列有九種變異型，但僅251位點與糞便中IL-8濃度增加有關(guān)[6]。本研究通過檢測IBD、IBS患者和正常人群中艱難梭菌的感染情況以及IL-8-251位點A/T基因多態(tài)性，旨在探討兩者之間的關(guān)系。

材料與方法

一、標本來源

選取2011年12月—2013年1月武漢大學中南醫(yī)院消化內(nèi)科和肛腸科就診的173例IBD患者[其中包括90例潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)患者和83例克羅恩病(Crohn’s disease, CD)患者]和76例IBS患者。173例IBD患者中，男87例，女86例；年齡14～78歲，平均(34.50±3.55)歲；76例IBS患者中，男37例，女39例；年齡22～67歲，平均(32.72±4.06)歲。IBD的診斷依據(jù)《炎癥性腸病診斷與治療的共識意見(2012年·廣州)》[7]，結(jié)合患者的臨床表現(xiàn)、內(nèi)鏡下表現(xiàn)和組織病理學進行綜合分析；IBS的診斷符合羅馬Ⅲ的診斷標準[8]，同時經(jīng)血、尿、糞、甲狀腺和腸道檢查排除其他器質(zhì)性疾病。排除標準：①患有慢性心、肺、肝腎功能損害等慢性基礎(chǔ)病；②長期規(guī)律或不規(guī)律服用某種藥物者；③經(jīng)常有腹部不適癥狀、排便不規(guī)律、性狀不正常者。以同期90名健康志愿者設(shè)為正常對照，其中男45名，女45名；年齡18～62歲，平均(34.56±4.37)歲。三組患者的性別構(gòu)成、年齡相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。本研究方案由武漢大學中南醫(yī)院倫理委員會審批通過，入選者均取得知情同意。

詳細記錄患者的病史和基本信息，研究對象全部為漢族，同時收集每例患者的糞便和血液標本，標本量不足以及其他原因不能進行研究者的標本排除在外。

二、方法

1. 標本的收集和處理：收集入選者未使用任何藥物前的第一次排便，置于-80 ℃冰箱凍存待測；抽取入選者空腹外周靜脈血2 mL，-80 ℃冰箱凍存待測。

2. 不同基因組DNA的提取：糞便基因組DNA的提取采用美國QIAGEN公司的QIAamp DNA Stool Mini Kit，具體操作步驟按試劑盒說明書進行。血液基因組DNA的提取采用天根生化科技(北京)有限公司TIANamp Blood DNA Kit，具體操作步驟按試劑盒說明書進行；艱難梭菌標準菌株購自中國微生物菌種保藏中心，使用CCFA培養(yǎng)基(頭孢甲氧噻吩-環(huán)絲氨酸-果糖-黃瓊脂)厭氧培養(yǎng)48 h，菌株基因組DNA的提取采用美國OMEGA公司E.Z.N.A.TMBacterial DNA Kit，具體操作步驟按試劑盒說明書進行。

3. PCR法檢測糞便中艱難梭菌毒素B：由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計針對艱難梭菌毒素B保守區(qū)的引物序列，上游：5’-TGC ACT TTG AAG AAA AAG GAG C-3’，下游：5’-TGG GTC TAT TCC TAC TTC TAA TGC T-3’，產(chǎn)物大小173 bp。PCR反應體系共25 μL，內(nèi)含上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL、2×PCR MIX(武漢眾一生物試劑公司)12.5 μL、超純水7.5 μL、DNA模板3 μL。擴增條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，共35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。以艱難梭菌標準菌株基因組DNA作為陽性對照，超純水作為陰性對照。

4. Sanger測序法測定IL-8-251位點A/T基因多態(tài)性：由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計IL-8引物序列，上游：5’-CCT TAC ATT GCT TTC TTC TTC TG-3’，下游：5’-TGC ACC CTC ATC TTT TCA TT-3’，產(chǎn)物大小661 bp。PCR反應體系共50 μL，內(nèi)含上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL、基因組DNA模板2 μL、ddH2O 22 μL、2×Taq PCR Master Mix(武漢眾一生物試劑公司)25 μL。PCR反應條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。擴增產(chǎn)物行Sanger測序，用DNAMAN進行序列比對，同時打開峰圖查看待檢測位點的熒光信號。

三、統(tǒng)計學分析

采用SAS 9.2統(tǒng)計軟件，計量數(shù)據(jù)的比較采用χ2檢驗，非正態(tài)資料的比較用秩和檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、艱難梭菌的感染情況

173例IBD患者中，共檢出艱難梭菌感染者28例，包括15例UC患者和13例CD患者；76例IBS患者中檢出2例艱難梭菌感染陽性；90名正常對照組檢出1名陽性感染者(表1)。

二、IL-8-251位點A/T基因多態(tài)性

IL-8-251位點的不同基因多態(tài)性見圖1。不同組別中艱難梭菌陽性感染者的IL-8-251位點AA基因型所占比例較高(表2)。艱難梭菌陽性者AA基因型比例顯著高于艱難梭菌陰性者(χ2=96.671 8，P<0.000 1)(表3)，提示IL-8-251位點AA基因型可能是艱難梭菌感染的危險因素。

討 論

艱難梭菌感染相關(guān)性疾病的發(fā)病率正逐步增高，已成為醫(yī)院內(nèi)感染的重要因素[9]。根據(jù)美國疾控預防中心的統(tǒng)計，每年感染艱難梭菌的病例約250 000 例，死亡率為1%～2.5%[10]。近年，隨著艱難梭菌感染病情嚴重程度的增加，其治療存在一定難度。醫(yī)院獲得性艱難梭菌感染還可顯著增加患者的住院時間，而與基礎(chǔ)的死亡風險無關(guān)[11]。艱難梭菌感染的相對危險因素包括使用廣譜抗菌藥物、伴有嚴重的基礎(chǔ)疾病、使用質(zhì)子泵抑制劑、處于免疫抑制狀態(tài)、使用激素、老齡、近期有手術(shù)史以及出現(xiàn)毒力更強的新型產(chǎn)毒菌株等[12]。IL-8是一種炎癥因子，在中性粒細胞趨化以及炎癥反應過程中起有重要作用，已有研究表明，IL-8基因啟動子區(qū)251位點與糞便中IL-8濃度增高有關(guān)[6]。IL-8-251位點A/T基因多態(tài)性對初發(fā)性或復發(fā)性艱難梭菌感染而言可能均為危險因素，該位點為AA基因型者的艱難梭菌感染率較高[6，13-14]。本研究中，UC、CD患者艱難梭菌陽性感染者的AA基因型比例較高，2例艱難梭菌陽性的IBS患者均為AA基因型，1例艱難梭菌陽性的正常對照者亦為AA基因型。此外，艱難梭菌陽性者的AA基因型比例顯著高于艱難梭菌陰性者(P<0.000 1)。提示IL-8-251位點AA基因型更容易發(fā)生艱難梭菌感染。

表1 各組艱難梭菌的感染情況 (n)

表2 各組艱難梭菌陽性、陰性患者IL-8-251位點A/T基因多態(tài)性比較(n)

表3 不同艱難梭菌感染組IL-8-251位點A/T基因型比較 n (%)

圖1 IL-8-251位點的基因多態(tài)性

總之，目前關(guān)于艱難梭菌與遺傳學、基因?qū)W之間關(guān)系的研究少見。本研究發(fā)現(xiàn)，IL-8-251位點AA基因型可能是艱難梭菌感染的危險因素，從而將艱難梭菌感染與遺傳學方面建立起了某種聯(lián)系，為研究艱難梭菌感染提供了新的思路。但本研究也受到一定的限制，如樣本量較小、未能區(qū)分初發(fā)型和復發(fā)型IBD患者，未來需行更深入的研究來進一步探討IL-8與艱難梭菌感染的關(guān)系。