王震凱 楊曉倩 葉雅沁 韋志琴 顧 燕 范青青 劉 丹* 汪芳裕

南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京中醫(yī)院內(nèi)鏡中心1(210008) 福建衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院2 東部戰(zhàn)區(qū)南京總醫(yī)院消化內(nèi)科3

背景：DNA甲基化在胃癌發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，但DNA甲基化需要DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)的修飾。目的：探討DNMTs在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及其臨床意義。方法：采集80例胃癌組織及其癌旁正常組織，以免疫組化法檢測(cè)DNMT1、DNMT3a、DNMT3b蛋白表達(dá)，并分析其與胃癌臨床病理特征的關(guān)系。采用qRT-PCR和蛋白質(zhì)印跡法分別檢測(cè)4種胃癌細(xì)胞株和正常胃黏膜上皮細(xì)胞株中DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)果：與癌旁組織相比，胃癌組織中DNMT1陽(yáng)性表達(dá)率顯著升高(68.8%對(duì)10.0%，P<0.01)。胃癌組織中DNMT1陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于DNMT3a和DNMT3b(68.8%對(duì)38.8%、40.0%，P<0.05)，而癌旁組織中DNMT1陽(yáng)性表達(dá)率顯著低于DNMT3a和DNMT3b(10.0%對(duì)60.0%、52.5%，P<0.05)。DNMT1陽(yáng)性表達(dá)與胃癌浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TNM分期明顯相關(guān)(P<0.05)，而DNMT3a和DNMT3b與胃癌臨床病理特征均無(wú)關(guān)。與正常胃黏膜上皮GES-1細(xì)胞相比，胃癌細(xì)胞株中DNMT1 mRNA和蛋白表達(dá)明顯增加，而DNMT3a和DNMT3b mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低。DNMT1表達(dá)與胃癌細(xì)胞分化程度有關(guān)(P<0.05)。結(jié)論：DNMT1可能在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中起有重要調(diào)節(jié)作用。

胃癌是最常見(jiàn)的消化道腫瘤之一，30%～50%的患者確診時(shí)已存在微轉(zhuǎn)移灶或臨床可檢出的轉(zhuǎn)移灶。因此，早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷仍是治療甚至治愈胃癌的關(guān)鍵。近年，表觀遺傳學(xué)與腫瘤發(fā)生的相關(guān)性研究已成為腫瘤病因?qū)W研究的重要內(nèi)容，其中DNA甲基化修飾為腫瘤發(fā)病機(jī)制的研究開辟了新的領(lǐng)域和思路。目前越來(lái)越多的研究證實(shí)，抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島高甲基化參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程[1-3]。DNA甲基化修飾須依賴DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferases, DNMTs)的催化作用，因此DNMTs是調(diào)控靶基因甲基化水平的關(guān)鍵因素。本研究通過(guò)比較胃癌及其癌旁組織、胃癌細(xì)胞株和正常胃黏膜上皮細(xì)胞株中DNMTs的表達(dá)差異，旨在探討DNMTs在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及其臨床意義。

材料與方法

一、材料來(lái)源

選取2012年1月—2015年1月南京總醫(yī)院確診的80例胃癌組織及其相應(yīng)癌旁正常組織(距腫瘤組織2 cm處)，所有組織均在外科手術(shù)或內(nèi)鏡黏膜下剝離術(shù)(ESD)過(guò)程中獲取，并經(jīng)病理學(xué)檢查明確診斷。其中男63例，女17例；年齡31～82歲，平均56歲。本研究方案獲得南京總醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò)，且取得患者或其家屬知情同意。人胃癌細(xì)胞株MKN-45(低分化)、AGS(高分化)、MKN-28(中分化)、HGC-27(未分化)和正常胃黏膜上皮細(xì)胞株GES-1均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

二、主要試劑

抗DNMT1鼠抗人抗體、抗DNMT3a鼠抗人抗體和抗DNMT3b鼠抗人抗體均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；EliVisionTMplus免疫組化試劑盒購(gòu)自于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司；增強(qiáng)型HRP-DAB底物顯色試劑盒購(gòu)自于上海酶聯(lián)生物研究所；TRIzol試劑為美國(guó)Invitrogen公司產(chǎn)品；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)Fermentas公司；蛋白質(zhì)印跡法所需試劑為碧云天研究所產(chǎn)品。

三、方法

1. 免疫組化法：應(yīng)用免疫組化PV二步法檢測(cè)胃癌組織中DNMT1、DNMT3a、DNMT3b蛋白表達(dá)。切片常規(guī)脫蠟，置于3% H2O2中浸泡5 min以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，PBS沖洗3次；隨后滴加10%山羊血清以避免非特異性結(jié)合；分別加入DNMT1、DNMT3a、DNMT3b一抗(工作濃度均為1∶100)4 ℃冰箱過(guò)夜，PBS沖洗3次；加入山羊抗小鼠二抗，室溫下孵育15 min，PBS沖洗3次；DAB顯色，顯微鏡下觀察，蒸餾水終止反應(yīng)，蘇木素復(fù)染，使用梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

結(jié)果判定：DNMTs主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，少數(shù)可在細(xì)胞核中表達(dá)。染色評(píng)分為陽(yáng)性細(xì)胞比例與染色強(qiáng)度之和。染色程度：不著色，0分；淡黃色，1分；黃色，2分；棕黃色或褐色，3分。陽(yáng)性細(xì)胞比例，≤25%，1分；25%～50%，2分；50%～75%，3分；>75%，4分。總評(píng)分為0～3分為陰性表達(dá)，4～7分為陽(yáng)性表達(dá)。

2. 實(shí)時(shí)qRT-PCR法：取各組細(xì)胞RNA 1 μg，嚴(yán)格按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。DNMT1正向引物：5’-GCT CTA GAT CCC TGA CAC CTA CCG-3’，反向：5’-GCT CTA GAC ATA AAG TTT AAT TTC CAC TC-3’；DNMT3a正向引物：5’-GGT CTA TGA AGT GAG GCA GAA GTG-3’，反向：5’-TTC AAA CTG CCG CAA GAA ATA C-3’；DNMT3b正向引物：5’-CCA GCT GAA GCC CAT GTT-3’，反向：5’-ATT TGT CTT GAA CGC TTG-3’；以β-actin作為內(nèi)參，正向引物：5’-AAG GAC CTC TAC GCC AAC ACG-3’，反向：5’-TTT GCG GTG GAC GAT GGA G-3’。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為20 μL，內(nèi)含SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ (×2) 10.0 μL、上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL、cDNA模板2.0 μL、ROX Reference Dye(×50) 0.4 μL、滅菌蒸餾水6.0 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，65 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)；68～74 ℃終延伸5～10 min。PCR產(chǎn)物行2.5%瓊脂糖凝膠電泳，Gel ID凝膠圖像分析系統(tǒng)攝片并分析。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量。

3. 蛋白質(zhì)印跡法：利用RIPA蛋白裂解液提取總蛋白，采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定樣本蛋白濃度；制備SDS-PAGE凝膠，每孔50 μg蛋白上樣，200 V電壓下電泳1 h；轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜，常規(guī)封閉，加入一抗(工作濃度均為 1∶1 000)，37 ℃溫育1 h；加入二抗(工作濃度1∶1 000)，37 ℃溫育1 h，利用ECL化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)，采用相關(guān)軟件行灰度掃描分析。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、DNMTs在胃癌組織中的表達(dá)

DNMT1在癌旁組織中以陰性表達(dá)為主，而在胃癌組織中以陽(yáng)性表達(dá)為主(圖1)。與癌旁組織相比，胃癌組織中DNMT1陽(yáng)性表達(dá)率顯著升高(68.8%對(duì)10.0%，P<0.01)。胃癌組織中DNMT1陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于DNMT3a和DNMT3b(68.8%對(duì)38.8%、40.0%，P<0.05)，而DNMT3a、DNMT3b陽(yáng)性表達(dá)率相比無(wú)明顯差異(P>0.05)。癌旁組織中DNMT1陽(yáng)性表達(dá)率顯著低于DNMT3a和DNMT3b(10.0%對(duì)60.0%、52.5%，P<0.05)(圖2)。

DNMT1陽(yáng)性表達(dá)與胃癌浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TNM分期明顯相關(guān)(P<0.05)，而DNMT3a、DNMT3b陽(yáng)性表達(dá)與胃癌臨床病理特征均無(wú)關(guān)(P>0.05)(表1)。

二、DNMTs在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)

DNMT1 mRNA在胃癌MKN-45、AGS、MKN-28和HGC-27細(xì)胞中的表達(dá)分別為GES-1細(xì)胞的2.74、1.73、2.03、2.16倍。低分化的MKN-45和未分化的HGC-27胃癌細(xì)胞中DNMT1 mRNA表達(dá)顯著高于高分化的AGS細(xì)胞(P=0.000)。而MKN-45、AGS、MKN-28和HGC-27細(xì)胞中DNMT3a、DNMT3b mRNA表達(dá)分別為GES-1細(xì)胞的0.51和0.63、0.62和0.5、0.81和0.42、0.58和0.55倍(圖3A、表2)。與正常胃黏膜GES-1細(xì)胞相比，不同分化的胃癌細(xì)胞中DNMT1蛋白表達(dá)明顯增加，而DNMT3a和DNMT3b 蛋白明顯降低(圖3B、表2)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，低分化的MKN-45和未分化的HGC-27胃癌細(xì)胞中DNMT1蛋白表達(dá)顯著高于高分化的AGS細(xì)胞(P=0.000)。

表1 DNMT1、DNMT3a和DNMT3b表達(dá)與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系 n (%)

A：DNMT1陰性；B：DNMT3a陰性；C：DNMT3b陰性；D：DNMT1陽(yáng)性；E：DNMT3a陽(yáng)性；F：DNMT3b陽(yáng)性

細(xì)胞株DNMT1mRNA表達(dá)蛋白表達(dá)DNMT3amRNA表達(dá)蛋白表達(dá)DNMT3bmRNA表達(dá)蛋白表達(dá)GES-10.26±0.040.12±0.010.49±0.020.68±0.020.73±0.030.92±0.08MKN-450.71±0.02#0.78±0.03#0.25±0.030.18±0.010.46±0.030.67±0.04#AGS0.45±0.050.30±0.020.30±0.040.24±0.010.37±0.040.38±0.02MKN-280.53±0.020.38±0.010.40±0.060.28±0.010.31±0.010.40±0.03HGC-270.56±0.03#0.54±0.02#0.28±0.030.30±0.020.40±0.020.53±0.03

*與GES-1細(xì)胞比較，P<0.05；#與AGS細(xì)胞比較，P<0.05

圖2 DNMTs在胃癌及其癌旁組織中的陽(yáng)性表達(dá)

1 Da=0.992 1 u

討 論

根據(jù)不同的作用，DNMTs可分為兩種類型：一種是重新甲基化酶，在哺乳動(dòng)物中包括DNMT3a和DNMT3b，主要在胚胎發(fā)育中起作用；另一種是維持甲基化酶，在哺乳動(dòng)物中主要為DNMT1，其為催化復(fù)制后的半甲基化，傳遞表觀遺傳學(xué)信息，維持重新甲基化完成后的甲基化狀態(tài)穩(wěn)定。

目前發(fā)現(xiàn)DNMT1、DNMT3a、DNMT3b異常表達(dá)均可導(dǎo)致抑癌基因發(fā)生甲基化從而影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。Lin等[4]的研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤組織中存在抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化而導(dǎo)致抑癌基因沉默，而基因高甲基化與DNMTs蛋白異常表達(dá)密切相關(guān)；許多腫瘤中DNMTs蛋白表達(dá)均明顯升高，如在有吸煙史的小細(xì)胞肺癌患者中，DNMTs家族多個(gè)成員(DNMT1、DNMT3a和DNMT3b)蛋白表達(dá)異常增高，與患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。Kim等[5]對(duì)非小細(xì)胞肺癌的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤中同時(shí)存在DNMT1和DNMT3b mRNA表達(dá)增加以及相關(guān)抑癌基因的高甲基化狀態(tài)。此外，在前列腺癌、結(jié)直腸癌、肝細(xì)胞癌、胃腸道間質(zhì)瘤等腫瘤中也存在DNMT1或DNMT3b高表達(dá)，通過(guò)下調(diào)其表達(dá)可使抑癌基因重新活化從而抑制腫瘤的生物學(xué)特性[6-9]。本研究發(fā)現(xiàn)，DNMT1在癌旁組織中以陰性表達(dá)為主，而在胃癌組織中以陽(yáng)性表達(dá)為主，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。且DNMT1陽(yáng)性表達(dá)與胃癌浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TNM分期明顯相關(guān)，而DNMT3a和DNMT3b陽(yáng)性表達(dá)與胃癌臨床病理特征均無(wú)關(guān)。初步提示DNMT1異常表達(dá)與胃癌的發(fā)生、發(fā)展可能存在關(guān)聯(lián)。與正常胃黏膜上皮GES-1細(xì)胞相比，不同分化程度的胃癌細(xì)胞株中DNMT1 mRNA和蛋白表達(dá)明顯增加，而DNMT3a、DNMT3b mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低。且DNMT1表達(dá)與胃癌細(xì)胞分化程度有關(guān)(P<0.05)。

隨著表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制的深入研究，有研究以DNMTs為靶點(diǎn)，采用其抑制劑如地西他濱和5-氮雜胞苷進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)，以期能逆轉(zhuǎn)腫瘤進(jìn)程和抑制腫瘤干細(xì)胞[10-11]。但腫瘤表觀遺傳研究屬新興科研領(lǐng)域，未知性和不確定性強(qiáng)。此外，如何引起DNMTs異常表達(dá)而致基因高甲基化的機(jī)制尚不明確，值得進(jìn)一步探討。

綜上所述，本研究結(jié)果表明DNMTs家族中的DNMT1可能在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中起有重要調(diào)節(jié)作用，但具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。