閆秀芳，張 鑫，范倩文

（上海家化聯(lián)合股份有限公司 科研部，上海 200080）

熊果苷即4-羥基苯基-D-吡喃葡萄糖苷，又名熊果甙、熊果素等。目前已知的熊果苷有α-熊果苷、β-熊果苷和脫氧熊果苷。

熊果苷除具有抗炎、抑菌、鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘等多種藥理作用外［1-3］，還是人黑色素細(xì)胞中酪氨酸酶的抑制劑，熊果苷能有效地抑制皮膚中的生物酪氨酸酶活性，阻斷黑色素的形成，通過(guò)自身與酪氨酸酶直接結(jié)合，加速黑色素的分解與排泄，從而減少皮膚色素沉積，去除色斑和雀斑［4，5］。因熊果苷美白效果好［6］，且毒副作用極小［7］，被廣泛地添加于美白類(lèi)化妝品中。但由于熊果苷的天然提取物來(lái)源少、提取步驟繁多、產(chǎn)量低，故大部分市售熊果苷都是由氫醌轉(zhuǎn)化而成。氫醌有很大的毒副作用，長(zhǎng)期使用可引起皮膚外源性黃褐斑和白斑病，其進(jìn)入血液后還會(huì)導(dǎo)致皮膚毒性、致癌性、遺傳毒性［8，9］等。若熊果苷中含有殘留的氫醌或者熊果苷分解成的氫醌都會(huì)給人體帶來(lái)傷害，所以，添加了熊果苷的化妝品的安全性問(wèn)題一直備受關(guān)注。調(diào)研發(fā)現(xiàn)市場(chǎng)上大部分熊果苷為β-熊果苷，α-熊果苷只有極少數(shù)廠家生產(chǎn)，而且售價(jià)是前者的8倍左右。為了模擬市售化妝品，本研究選用β-熊果苷研究其在化妝品中的穩(wěn)定性。

本文以高效液相色譜法測(cè)定β-熊果苷分解產(chǎn)生的氫醌的含量為指標(biāo)，來(lái)分析不同含量的β-熊果苷水溶液在不同pH、溫度、放置時(shí)間以及表皮葡萄球菌（皮膚表面寄生菌群代表）、表皮細(xì)胞等因素對(duì)β-熊果苷穩(wěn)定性的影響。同時(shí)研究β-熊果苷原料在不同溫度、不同濕度下的穩(wěn)定性，進(jìn)一步研究維生素C、珍珠粉對(duì)β-熊果苷穩(wěn)定性的影響。以期為今后添加β-熊果苷的水劑、粉劑類(lèi)美白化妝品的配方設(shè)計(jì)、生產(chǎn)、包裝設(shè)計(jì)以及存儲(chǔ)和運(yùn)輸提供一定的理論指導(dǎo)作用。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

Waters 2695高效液相色譜儀，配2487紫外檢測(cè)器，美國(guó)Waters；XS205電子天平，梅特勒-托利多公司；培養(yǎng)箱，3M集團(tuán)。

β-熊果苷，w≥99.0%，北京貝麗萊斯生物化學(xué)有限公司；氫醌標(biāo)準(zhǔn)品，w≥99.0%，梯希愛(ài)（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；磷酸二氫鉀（KH2PO4），分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；磷酸，色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙腈、甲醇，色譜純，默克股份兩合公司； 表皮葡萄球菌，ATCC12228，ATCC公司； 表皮細(xì)胞，ATCC公司。

10 mmol/L KH2PO4水溶液配制：取1.36 g KH2PO4于1 L容量瓶中，加水定容至刻度，待用。

1.2 色譜條件

ZORBAX SB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫25 ℃；流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為10 mmol/L KH2PO4水溶液，采用等度洗脫程序（V（A）∶V（B）=5∶95），流動(dòng)相使用前經(jīng)0.45 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)290 nm。

1.3 不同含量β-熊果苷水溶液以及含β-熊果苷的粉劑類(lèi)化妝品的穩(wěn)定性考察

不同含量的β-熊果苷水溶液的制備：配制3%，5%和10%的β-熊果苷水溶液。分別將3種不同含量的β-熊果苷水溶液均分成3份，其中2份用磷酸調(diào)節(jié)pH=3和5，然后分別將β-熊果苷原液和pH=3和5的β-熊果苷水溶液分裝成3小瓶，每瓶50 mL。貼好標(biāo)簽，分別存放于25，40和60 ℃的培養(yǎng)箱中。

β-熊果苷原料制備：取β-熊果苷原料，均分成12份，每份15 g，貼好標(biāo)簽，分別存放于 25 ℃，20%濕度；40 ℃，18%濕度；60 ℃，15%濕度以及40 ℃，75%濕度的培養(yǎng)箱中，每個(gè)條件下放3瓶做平行試驗(yàn)。

β-熊果苷+維生素C 粉類(lèi)復(fù)配物樣品制備：配制含2%維生素C+98% β-熊果苷的粉劑類(lèi)復(fù)配物樣品。均分成12份，每份15 g，貼好標(biāo)簽，分別存放于25 ℃，20%濕度；40 ℃，18%濕度；60 ℃，15%濕度以及40 ℃，75%濕度的培養(yǎng)箱中，每個(gè)條件下放3瓶做平行試驗(yàn)。

β-熊果苷+維生素C+珍珠粉粉類(lèi)復(fù)配物樣品制備：配制2%維生素C+10%珍珠粉+88% β-熊果苷的粉類(lèi)復(fù)配物樣品。均分成12份，每份15 g，貼好標(biāo)簽，分別存放于25 ℃，20%濕度；40 ℃，18%濕度；60 ℃，15%濕度以及40 ℃，75%濕度的培養(yǎng)箱中，每個(gè)條件下放3瓶做平行試驗(yàn)。

1.4 溫度、含量對(duì)β-熊果苷水溶液穩(wěn)定性的影響試驗(yàn)

將放置在25，40和60 ℃的培養(yǎng)箱中的含量為3%，5%和10%的β-熊果苷水溶液原液，在不同的時(shí)間點(diǎn)1，2，4，8和12周分別取樣1 g至10 mL的比色管中，用 體積比為1∶1的甲醇-水溶液稀釋定容。用高效液相色譜法測(cè)定是否有氫醌產(chǎn)生。

1.5 pH對(duì)β-熊果苷水溶液穩(wěn)定性的影響試驗(yàn)

將放置在25，40和60 ℃的培養(yǎng)箱中，不同含量、pH=3和5的β-熊果苷水溶液在不同的時(shí)間點(diǎn)1，2，4，8和12周分別取樣1 g至10 mL的比色管，用體積比為1∶1的甲醇-水溶液稀釋定容。用高效液相色譜法測(cè)定是否有氫醌產(chǎn)生。

1.6 表皮葡萄球菌對(duì)β-熊果苷水溶液穩(wěn)定性的影響試驗(yàn)

以本單位化妝品為例，β-熊果苷在化妝品中的添加量一般不會(huì)大于2%。考慮到實(shí)際化妝品中β-熊果苷的添加量，配制含有0，0.125%，0.5%和2% β-熊果苷的細(xì)菌培養(yǎng)液，均分成3份。其中1份加入表皮葡萄球菌，在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。另2份不加菌，分別在4和37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。用高效液相色譜法測(cè)定是否有氫醌產(chǎn)生。

1.7 表皮細(xì)胞對(duì)β-熊果苷水溶液穩(wěn)定性的影響試驗(yàn)

配制含有β-熊果苷0%，0.125%，0.5%和2%的細(xì)胞培養(yǎng)液，均分成2份。其中一份加入表皮細(xì)胞，另一份不加細(xì)胞。分別在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。用高效液相色譜法測(cè)定是否有氫醌產(chǎn)生。

1.8 溫度和濕度對(duì)β-熊果苷原料穩(wěn)定性的影響試驗(yàn)

將放置于25 ℃，20%濕度；40 ℃，18%濕度；60 ℃，15%濕度以及40 ℃，75%濕度的培養(yǎng)箱中的β-熊果苷原料分別在不同的時(shí)間點(diǎn)1，2，4，8和12周取樣1 g至10 mL的比色管中，用體積比為1∶1的甲醇-水溶液稀釋定容。用高效液相色譜法測(cè)定是否有氫醌產(chǎn)生。

1.9 維生素C和珍珠粉對(duì)β-熊果苷穩(wěn)定性的影響試驗(yàn)

維生素C和珍珠粉是美白化妝品中常用的復(fù)配原料，研究含有維生素C、珍珠粉和β-熊果苷的美白粉劑復(fù)配物，發(fā)現(xiàn)三者復(fù)配后，β-熊果苷不穩(wěn)定，有氫醌產(chǎn)生。為進(jìn)一步研究維生素C和珍珠粉對(duì)β-熊果苷穩(wěn)定性的影響，將含有2%維生素C的β-熊果苷以及含有2%維生素C和10%的珍珠粉的β-熊果苷放置于25 ℃，20%濕度；40 ℃，18%濕度；60 ℃，15%濕度以及40 ℃，75%濕度的培養(yǎng)箱中，分別在1，2，4，8和12周取樣1 g至10 mL的比色管中，用體積比為1∶1的甲醇-水溶液稀釋定容。用高效液相色譜法測(cè)定是否有氫醌產(chǎn)生。

2 結(jié)果與討論

2.1 溫度、含量對(duì)β-熊果苷水溶液穩(wěn)定性的影響

不同溫度對(duì)β-熊果苷水溶液穩(wěn)定性的影響如表1所示。溫度對(duì)含量為3%和5%的β-熊果苷水溶液的穩(wěn)定性影響不大，在放置12周時(shí)，25 ℃放置溫度條件下，開(kāi)始檢出氫醌。當(dāng)β-熊果苷水溶液的含量進(jìn)一步增大到10%時(shí)，放置在25與60 ℃下，4周時(shí)已開(kāi)始檢測(cè)到氫醌，且在60 ℃下，放置12周后，氫醌的含量達(dá)到3 615.3 μg/g。

2.2 pH對(duì)β-熊果苷水溶液穩(wěn)定性的影響

不同pH對(duì)β-熊果苷水溶液穩(wěn)定性的影響如表1所示。因人體皮膚的pH=5.5左右，護(hù)膚品的pH=4～7，所以未考察堿性條件對(duì)β-熊果苷穩(wěn)定性的影響。由表1可以看出，相同含量、相同溫度下，pH=5時(shí)β-熊果苷最穩(wěn)定。pH=3時(shí)最不穩(wěn)定。同時(shí)發(fā)現(xiàn)3個(gè)不同含量的β-熊果苷水溶液，在pH=5，溫度為40 ℃時(shí)，放置12周均未產(chǎn)生氫醌。這對(duì)β-熊果苷在化妝品膏霜、乳液和化妝水中應(yīng)用時(shí)溫度的控制有一定的指導(dǎo)意義。

表 1 溫度、含量和pH對(duì)β-熊果苷水溶液穩(wěn)定性的影響Tab.1 Ef fect of temperature， content and pH on the stability ofβ-arbutin aqueous solutions

2.3 表皮葡萄球菌對(duì)β-熊果苷水溶液穩(wěn)定性的影響

含β-熊果苷的化妝品涂抹在表皮上，經(jīng)皮膚滲透，β-熊果苷與酪氨酸酶直接結(jié)合，加速黑色素的分解與排泄，從而減少皮膚色素沉積，祛除色斑和雀斑［4，5］。在人體表皮中有很多表皮細(xì)菌，若β-熊果苷在人體表皮層被細(xì)菌分解，就大大降低了β-熊果苷的美白效果。其中表皮葡萄球菌是皮膚表面常駐菌，且容易培養(yǎng)。如表2所示，以表皮葡萄球菌為例，其在含有不同含量β-熊果苷培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，均未檢測(cè)到氫醌，說(shuō)明表皮葡萄球菌不會(huì)導(dǎo)致β-熊果苷分解產(chǎn)生氫醌。

表 2 表皮葡萄球菌對(duì)β-熊果苷水溶液穩(wěn)定性的影響Tab.2 Effect of Staphylococcus epidermidis on the stability of β-arbutin aqueous solutions

2.4 表皮細(xì)胞對(duì)β-熊果苷水溶液穩(wěn)定性的影響

表皮細(xì)胞對(duì)β-熊果苷穩(wěn)定性的影響見(jiàn)表3。由表3可知，在未添加細(xì)胞的培養(yǎng)液中，24 h后未檢測(cè)到氫醌，在有表皮細(xì)胞的培養(yǎng)液中，隨著培養(yǎng)液中熊果含量的增高，檢測(cè)到的氫醌含量也在上升。同時(shí)觀察到，表皮細(xì)胞未見(jiàn)死亡，說(shuō)明在此β-熊果苷分解產(chǎn)生的低含量的氫醌條件下，未產(chǎn)生細(xì)胞毒性。表皮細(xì)胞對(duì)β-熊果苷的分解有促進(jìn)作用，這也為護(hù)膚品中β-熊果苷的添加量提供了指導(dǎo)作用。

表 3 表皮細(xì)胞對(duì)β-熊果苷水溶液穩(wěn)定性的影響Tab.3 Effect of epidermal cell on the stability of β-arbutin aqueous solutions

2.5 溫度、濕度對(duì)β-熊果苷原料穩(wěn)定性的影響

表4為溫度、濕度對(duì)β-熊果苷原料穩(wěn)定性的影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。由表4可以看出，在不同的溫度、濕度條件下放置12周后，均未分解產(chǎn)生氫醌。說(shuō)明β-熊果苷原料在不同的溫度、濕度條件下均很穩(wěn)定。

表 4 溫度、濕度對(duì)β-熊果苷原料穩(wěn)定性的影響Tab.4 Effect of temperature and humidity on the stability of β-arbutin

2.6 維生素C和珍珠粉對(duì)β-熊果苷穩(wěn)定性的影響

維生素C對(duì)β-熊果苷穩(wěn)定性的影響如圖1所示。由圖1可知，在25 ℃，20%濕度；40 ℃，18%濕度；60 ℃，15%濕度的條件下放置12周，均未檢出氫醌，在40 ℃，75%的條件下放置，隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)，釋放的氫醌含量也在升高，12周后氫醌的含量達(dá)到344 μg/g。這一結(jié)果表明在潮濕的環(huán)境中維生素C會(huì)促進(jìn)β-熊果苷分解產(chǎn)生氫醌，粉類(lèi)化妝品β-熊果苷在與維生素C復(fù)配使用時(shí)，儲(chǔ)存的環(huán)境要干燥。

圖2為維生素C與珍珠粉對(duì)β-熊果苷穩(wěn)定性的影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。由圖2可知，除放置在25 ℃，20%濕度條件下，儲(chǔ)存1周，未檢出氫醌外，其余條件下均有氫醌檢出，且在40 ℃，75%的條件下釋放產(chǎn)生的氫醌達(dá)822 μg/g。分析其原因可能是維生素C在吸濕吸潮的情況下會(huì)顯酸性，β-熊果苷在酸性條件下是不穩(wěn)定的。高含量的β-熊果苷粉類(lèi)化妝品不宜與維生素C、珍珠粉復(fù)配使用。

2.7 討論

本文模擬了β-熊果苷在化妝水中可能的添加量、可能的pH環(huán)境，化妝品穩(wěn)定性考察的加速試驗(yàn)條件（40 ℃，3個(gè)月），設(shè)計(jì)了含量分別為3%，5%和10%，調(diào)節(jié)pH分別為3、5和原液，放置于25，40和60 ℃ 12周，考察其穩(wěn)定性。試驗(yàn)結(jié)果表明β-熊果苷的水溶液在弱酸性（pH=5、原液）環(huán)境中，25和40 ℃條件下比較穩(wěn)定；60 ℃條件下，放置4周后，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，會(huì)釋放出氫醌。在酸性（pH=3）環(huán)境中，25 ℃條件下，4周內(nèi)比較穩(wěn)定，4周后，β-熊果苷會(huì)分解釋放出氫醌。高溫（40和60 ℃）條件下，1周內(nèi)均有氫醌產(chǎn)生。秦良等［10］考察了0.9%的熊果苷水溶液在pH=1，5.2，8.0，13，室溫下放置3 d的穩(wěn)定性，結(jié)果表明pH=5.2和8.0的0.9%的熊果苷放置3 d是穩(wěn)定的，在pH=1和13時(shí)不穩(wěn)定。田宇等［11］的研究結(jié)果表明在化妝水、乳液、膏霜、面膜中添加5%的β-熊果苷，4～45 ℃條件下放置30 d，β-熊果苷在4種劑型中穩(wěn)定性較好。本研究與秦良、田宇等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相比，同時(shí)考察了pH與溫度、放置時(shí)間延長(zhǎng)到12周，對(duì)β-熊果苷穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明，溫度、pH共同作用會(huì)影響β-熊果苷的穩(wěn)定性，且隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)，分解產(chǎn)生的氫醌越多。

本文進(jìn)一步研究了表皮葡萄球菌、表皮細(xì)胞分別與β-熊果苷共孵育24 h，發(fā)現(xiàn)表皮葡萄球菌不會(huì)導(dǎo)致β-熊果苷分解產(chǎn)生氫醌，表皮細(xì)胞會(huì)促進(jìn)β-熊果苷的分解。房軍等［12］研究了人手表皮微生物與β-熊果苷共孵育48 h，發(fā)現(xiàn)β-熊果苷分解產(chǎn)生氫醌。本研究相比于房軍的實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步研究了表皮細(xì)胞對(duì)β-熊果苷穩(wěn)定性的影響，同時(shí)發(fā)現(xiàn)表皮微生物中的表皮葡萄球菌并沒(méi)有導(dǎo)致β-熊果苷分解產(chǎn)生氫醌，分析原因，可能是表皮微生物中的其他菌群促進(jìn)了β-熊果苷的分解。同時(shí)本文通過(guò)模擬藥物穩(wěn)定性的加速實(shí)驗(yàn)，研究了高溫高濕（40 ℃，75%濕度）條件對(duì)β-熊果苷原料、以及添加 了維生素C和珍珠粉后的β-熊果苷原料復(fù)配物穩(wěn)定性的影響，發(fā)現(xiàn)β-熊果苷原料在不同溫度、濕度下均很穩(wěn)定，添加了維生素C和珍珠粉的β-熊果苷的穩(wěn)定性會(huì)降低。

3 結(jié)論

本文通過(guò)高效液相色譜法檢測(cè)β-熊果苷水溶液及含有β-熊果苷的粉劑類(lèi)樣品中是否產(chǎn)生氫醌，來(lái)分析β-熊果苷穩(wěn)定性。結(jié)果表明，β-熊果苷水溶液在pH=5，溫度為40 ℃時(shí)相對(duì)比較穩(wěn)定，pH=3時(shí)相對(duì)不穩(wěn)定，且隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)，β-熊果苷分解產(chǎn)生的氫醌越多。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)表皮葡萄球菌不會(huì)導(dǎo)致β-熊果苷分解產(chǎn)生氫醌。表皮細(xì)胞會(huì)促進(jìn)β-熊果苷的分解，且隨著β-熊果苷含量的增加，分解產(chǎn)生的氫醌越多。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)β-熊果苷原料在不同溫度、濕度下均很穩(wěn)定。在β-熊果苷中加入維生素C，珍珠粉等，β-熊果苷的穩(wěn)定性會(huì)降低。這一研究對(duì)原料儲(chǔ)藏、β-熊果苷在化妝品中使用的添加量以及復(fù)配物的選擇有一定的指導(dǎo)意義。