朱 雯，馬煜明，曾 莉，胡 斌，劉亞楠，周立亭，陳明珠

（1.華中農業(yè)大學 園藝林學學院，湖北 武漢 430070；2.浙江茗皇天然食品開發(fā)股份有限公司，浙江 龍游 324400；3.武夷學院 茶與食品學院，福建 武夷山 354300）

甜茶(Rubus chingiivar.suavissimus)屬薔薇科懸鉤子屬植物，主要分布于廣西、云南、四川和湖南等地，因其葉味甜而常做茶飲，故稱“甜茶”[1]。甜茶是天然的藥食兼用植物，具有無糖自然甜的特性，非常適合糖尿病病人飲用，同時還具有生津潤肺、止咳化痰、抗衰老、消炎等功效[2]。金花菌作為茯磚茶“發(fā)花”和形成其特征品質的優(yōu)勢菌種，已得到廣泛的關注和研究。有研究表明，金花菌發(fā)酵過程中可引起發(fā)酵原料的內含物質的變化，還能產生豐富的次生代謝產物，改善發(fā)酵原料的品質[3]，提高發(fā)酵原料的功效[4]。為此，本試驗利用金花菌人工接種發(fā)酵甜茶，分析金花菌對發(fā)酵甜茶生化品質和抗氧化活性的影響，研究結果為金花菌發(fā)酵甜茶的生化基礎和特色甜茶產品開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

實驗菌種為華中農業(yè)大學茶學系茶葉生物加工與技術課題組從茯磚茶中篩選出優(yōu)勢金花菌。甜茶原料為廣西甜茶。試劑購于國藥集團化學試劑有限公司，均為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 金花甜茶的制備

孢子懸浮液制備： 刮取PDA（Potato Dextrose Agar）平板上培養(yǎng)約一周的金花菌接入無菌水中（每2個平板接入30 mL 無菌水），置于離心機中3000 r/min 條件下離心5 min，上清液即為孢子懸浮液。

金花菌發(fā)酵甜茶：取20 g 甜茶裝入發(fā)酵罐中，121℃滅菌21 min，冷卻后每瓶接種1 mL金花菌懸浮液，加入無菌水至含水量為40%。置于28℃恒溫培養(yǎng)，4 d 后取出置于烘箱中，在40℃條件下干燥120 min 左右，至手揉可成粉末、含水量為4%～6%即可。同時，以甜茶不接種金花菌懸浮液，加入等量無菌水進行發(fā)酵，作為金花甜茶對照（ck）。

1.2.2 生化成分測定

游離氨基酸含量測定：茚三酮比色法；可溶性糖含量測定：蒽酮比色法；水浸出物含量測定：恒重法；茶多酚含量測定：GB/T 8313-2008 Folin-酚試劑法；黃酮含量測定：SZDB/Z 349-2019 食品中總黃酮的測定 分光光度法。

1.2.3 抗氧化活性測定

茶湯提取：稱取1.5 g 茶粉，加入20 mL 蒸餾水于90℃水浴鍋中水浴30 min，每10 min 搖一次。提取后冷卻，4200 r/min 下離心15 min，取上清液加蒸餾水定容到25 mL 容量瓶。

清除羥自由基活性測定方法：取10 mL 離心管→加入1 mL 4 mmoL/L 水楊酸-無水乙醇 →1 mL 4 mmol/L FeSO4溶液→1 mL樣品液→1 mL 4 mmol/L H2O2→37 ℃溫度水浴30 min →3600 r/min 離心5 min 待測→510 nm 波長下（以蒸餾水作為參比液）測定樣品組吸光值Ax、模型對照組A0（樣品空白）和樣品對照組AX0（試劑空白）。清除率S（%）=[1-（Ax-AX0）/A0]×100[5]。

總抗氧化能力測定方法（FRAP 法）：取3 mL FRAP 至5 mL 離心管中→37 ℃水浴中預熱10 min →加入0.1 mL 待測液→反應30 min →取出冷卻至室溫（以蒸餾水作對照，于595 nm 處測定吸光值A）。以硫酸亞鐵為標準溶液0.2～2 mmol 的FeSO4的標準溶液代替樣品繪制標準曲線，將OD值代入標準曲線，計算相當于硫酸亞鐵的量。標準曲線：C=0.4026*A+0.008 R2=0.9993（C表示相當于硫酸亞鐵的濃度，單位g/L）。計算1 g 茶相當于硫酸亞鐵的mg 量，單位mg/g：M=C*25*d/m*m0(d 稀釋倍數(shù)，m 稱取茶葉的重量，m0茶葉的干物質重）[6]。

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除活性測定方法：取2 mL 茶湯于試管中→加入2 mL 新鮮配制的0.15 mmol DPPH 溶液→混合均勻→室溫遮光反應30 min→517 nm處（以95%乙醇作為參比液）測定吸光值樣品組Ax、模型對照組A0（樣品空白）和樣品對照組AX0（試劑空白）。清除率S（%）=[1-（Ax-Ax0）/A0]×100[7]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)經Excel 和SPSS 13.0 處理，大寫字母和小寫字母分別表示Duncan’s 新復極差(SSR)在p＜0.01 和p＜0.05 水平下的差異顯著性，字母不同表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 金花菌發(fā)酵甜茶中游離氨基酸、可溶性糖與水浸出物的含量

甜茶經過人工接種發(fā)酵后，游離氨基酸含量與原料和ck 相比都有顯著性差異，分別降低了37.2%和37.6%；可溶性糖含量與原料和ck相比也都有顯著性差異，分別降低了13.9%和15.9%。接種金花菌后的甜茶的水浸出物對比甜茶原料并沒有顯著性差異，但是ck 對比甜茶原料水浸出物降低了4.8%。傅冬和等人研究茯磚茶加工過程中化學成分變化，其中氨基酸含量下降36.84%，可溶性糖和水浸出物含量沒有明顯變化[8]。虞飛人工接種金花菌發(fā)酵茶，發(fā)酵過程中氨基酸和水浸出物含量隨時間的增加不斷減少，但可溶性糖的含量則呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢[9]。接種金花菌后，金花菌在甜茶表面生長消耗部分甜茶本身的營養(yǎng)物質，這可能是接種金花菌后游離氨基酸含量與可溶性糖含量都顯著降低的原因。

2.2 金花菌發(fā)酵甜茶中茶多酚與黃酮含量

甜茶經過人工接種金花菌發(fā)酵后，對比原料，茶多酚含量和黃酮含量顯著增加，增加幅度分別達到33.6%和11.0%，但對比ck，茶多酚含量和黃酮含量均沒有顯著性差異。有研究結果表明，微生物發(fā)酵過程中茶葉中多酚類物質在微生物外源酶的作用下被降解，大分子的兒茶素聚合體也被降解為小分子物質，最終導致茶多酚總含量呈現(xiàn)下降趨勢。薛志強等人利用從普洱茶中分離的頂頭孢霉進行罐裝發(fā)酵普洱茶的試驗時也出現(xiàn)對照組和試驗組黃酮類含量隨著發(fā)酵時間的延長持續(xù)上升，但對照組與試驗組并不存在顯著差異的現(xiàn)象[10]。秦俊哲等人通過人工接種金花菌發(fā)酵茯磚茶，發(fā)花過程中茶多酚含量持續(xù)降低，最后加工為成品茶時茶多酚含量呈現(xiàn)回升[11]。本試驗中甜茶發(fā)酵后茶多酚含量增加可能是由于高溫滅菌或者發(fā)酵過程中的濕熱反應導致甜茶內含物質變化，甜茶色澤變化進而影響分光光度計測試時的吸光值，出現(xiàn)相對于未發(fā)酵原料來說含量增加的反常情況。

表1 不同處理甜茶內含成分（g/kg）Table 1 The components of sweet tea with different treatment（g/kg）

圖1 不同處理甜茶的抗氧化活性Fig.1 The anti-oxidative activities of sweet tea with different treatment

2.3 金花菌發(fā)酵甜茶的抗氧化能力

2.3.1 清除羥自由基活性

清除羥自由基活性方面，甜茶原料經過高溫滅菌加水發(fā)酵處理后，清除羥自由基活性顯著降低，IC50值降低至2.09 g/L，相比于甜茶原料降低率達40.6%；而加入金花菌發(fā)酵的實驗組與原料相比也顯著降低，IC50值降低至2.39 g/L，降低率達32.1%。金花菌發(fā)酵甜茶與ck 清除羥自由基活性沒有顯著性差異。本試驗中可能由于高溫滅菌導致甜茶中的某些抗氧化活性物質的急劇降低，使得ck 與實驗組中的抗羥自由基活性顯著性降低。

2.3.2 總抗氧化活性

以RFAP 清除活性法分析不同處理甜茶的總抗氧化性時，與甜茶原料相比，ck 和金花菌發(fā)酵甜茶總抗氧化活性都顯著升高，分別升高了107.3%和46.1%。高溫滅菌以及發(fā)酵過程中的某些變化都可能導致處理后甜茶的總抗氧化活性顯著性提升[11]。李磊研究發(fā)現(xiàn)茶多酚的RFAP抗氧化活性隨著EGCG 濃度的升高而增加[12]。賈學靜等人測定老鷹茶總黃酮抗氧化活性，成熟葉老鷹茶質量濃度20 g/L 時，DPPH 自由基清除率66.66%，RFAP值相當于2.05 mmol/L FeSO4，并呈一定的量效關系[13]。而本試驗中總抗氧化活性顯著升高可能與金花菌發(fā)酵甜茶中茶多酚和黃酮類物質含量增加有關。

2.3.3 DPPH 自由基清除活性

DPPH 自由基清除活性方面，與甜茶原料相比，ck 和金花菌發(fā)酵甜茶DPPH 自由基清除活性顯著性降低，分別降低了28.4%和29.3%。分析原因可能與清除羥自由基活性差異原因一致。李玉婷等人對金花菌黃色素進行研究，結果表明，低濃度黃色素具有明顯高于維生素E (VE)的還原能力、DPPH 自由基清除率和溶血抑制率，其中DPPH 自由基的IC50 低于50 mg/L[14]。歐陽梅[15]等人人工接種冠突散囊菌發(fā)酵茶葉并測定發(fā)酵茶抗氧化活性，結果表明，發(fā)酵茶對DPPH 和ABTS 兩種自由基的清除能力分別達到75%和56%以上，而對DPPH 的清除能力略低于對照，與本試驗結果一致。雖然金花菌本身產生的次生代謝物質具有清除DPPH 自由基的能力，但是發(fā)酵過程中金花菌對于原料本身內含物質的改變情況并不明確，因此并不能判斷金花菌發(fā)酵茶葉一定會提高茶葉的DPPH 自由基清除活性。

3 討論

3.1 接種金花菌發(fā)酵對內含成分的影響

通過外源性添加安全可控的微生物不僅會對茶葉的內含物質成分產生影響，更會對茶葉的風味進行深刻地改變，形成獨特的香氣滋味等。楊久玲[16]等通過接種可以產生醬香風味的微生物發(fā)酵紅茶，對照茶樣與醬香風味茶樣比較，兩者的游離氨基酸含量差異顯著，茶多酚等差異不顯著，醬香風味紅茶中的部分游離氨基酸是發(fā)酵液中加入的。譚雪[17]等利用金花菌發(fā)酵夏秋鮮葉發(fā)現(xiàn)，接種金花菌會提升游離氨基酸含量與可溶性糖含量，水浸出物含量會隨著發(fā)酵過程逐漸降低。本試驗中甜茶經過人工接種發(fā)酵金花菌后，其游離氨基酸含量與可溶性糖含量顯著下降，茶多酚含量與黃酮含量顯著升高，而對水浸出物含量無顯著性影響。

3.2 接種金花菌發(fā)酵對抗氧化活性的影響

本試驗結果表明，甜茶經過人工接種金花菌發(fā)酵后，總抗氧化活性顯著提高，羥基自由基清除活性和DPPH 自由基清除活性顯著降低。潘慧敏[18]等通過對7種廣西產甜茶抗氧化活性的比較，藤茶具有很好的清除DPPH 自由基的能力。王婉瑩[19]等通過建立了藤茶UPLCDAD 指紋圖譜，對藤茶DPPH 自由基清除活性的譜效關系進行了研究，結果表明雙氫楊梅素是藤茶清除DPPH 自由基活性的最大貢獻成分；并對藤茶的抗氧化活性的日常沖泡工藝進行優(yōu)化，結果表明l g 藤茶加56 mL (80℃)的水，沖泡5.8 min 時，藤茶DPPH 自由基的清除率可達86.49%。