侯海，羅超，陳中豪，鄧旭東，孫瑤，王祥喜

1 西北工業(yè)大學 空間生物實驗模擬技術(shù)國防重點學科實驗室 生命學院，陜西 西安 710072

2 中國科學院生物物理研究所 生物大分子國家重點實驗室，北京 100101

谷氨酸脫氫酶 (Glutamate dehydrogenase，GDH) (E.C.1.4.1.2–1.4.1.4) 是一種線粒體酶，普遍存在于動植物和微生物體內(nèi)[1-2]，屬于氨基酸脫氫酶超家族[3]，在生物體氮和碳的代謝過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[4]。一般情況下，該酶以NAD+和/或NADP+作為輔酶催化L-谷氨酸可逆氧化脫氨，生成ɑ-酮戊二酸，從而參與三羧酸循環(huán) (TCA循環(huán))、信號轉(zhuǎn)導、氮和碳代謝的調(diào)節(jié)及其他生理活動[5-6]。在能量調(diào)節(jié)、維持細胞穩(wěn)態(tài)等方面具有重要作用。

1 GDH的分類

1.1 根據(jù)寡聚體狀態(tài)分類

現(xiàn)有研究報道已從多種類型的生物體內(nèi)分離得到谷氨酸脫氫酶，并對其進行測序。依照寡聚體的狀態(tài)，谷氨酸脫氫酶可以被分為2種類型：細菌和真菌的NADP (H) 特異性谷氨酸脫氫酶以及脊椎動物的NAD (H)/NADP (H) 雙特異性谷氨酸脫氫酶。這些GDH均以同源六聚體的形式發(fā)揮功能，每個亞基的分子量約為48 kDa (細菌) 或50 kDa (脊椎動物)；而NAD (H) 特異性谷氨酸脫氫酶既存在亞基分子量約為48 kDa的同源六聚體蛋白 (例如消化鏈球菌、共生梭菌)，也存在亞基分子量約為115 kDa的同源四聚體蛋白 (例如釀酒酵母、粗糙鏈孢菌)[7-8]。

1.2 根據(jù)輔酶的特異性分類

谷氨酸脫氫酶在催化L-谷氨酸的氧化脫氨基反應時需要NAD+/NADP+作為輔酶，根據(jù)輔酶特異性不同，谷氨酸脫氫酶可以被分成3類：NAD (H)特異性谷氨酸脫氫酶、NADP (H) 特異性谷氨酸脫氫酶以及NAD (H)/NADP (H) 雙特異性谷氨酸脫氫酶。不同特異性的谷氨酸脫氫酶在功能上存在不同的偏向性，NAD (H) 特異性谷氨酸脫氫酶主要參與谷氨酸的分解代謝，NADP (H) 特異性谷氨酸脫氫酶通常在氨的合成代謝中發(fā)揮作用[9]。而NAD (H) /NADP (H) 雙特異性谷氨酸脫氫酶在發(fā)揮催化作用時會受到一些小分子 (如ATP和GTP) 的變構(gòu)調(diào)節(jié)作用。ATP能夠通過輔助產(chǎn)物的釋放加快催化反應的速率，而GTP則會阻止產(chǎn)物的釋放從而對催化反應產(chǎn)生抑制作用[10]。

2 GDH與腫瘤的關(guān)系

腫瘤的典型特征是異常的能量代謝和無限增殖。人類腫瘤在癌變期間獲得6種生物學能力，包括維持增殖信號、預防生長抑制、抵制細胞死亡、無限復制、促進新血管形成及激活侵襲和轉(zhuǎn)移，這些特征導致了腫瘤疾病的復雜性。除了癌細胞之外，腫瘤還表現(xiàn)出另一方面的復雜性：它們具有征募性，即表面上正常的細胞可以通過創(chuàng)建一個“腫瘤微環(huán)境”來幫助其得到標志性特征[11]。

許多研究表明，雖然谷氨酰胺可以在大多數(shù)組織中合成，但其需求量往往超過供應量。谷氨酰胺通常是細胞增殖的必需營養(yǎng)物[12-13]。越來越多的研究表明，谷氨酰胺代謝在腫瘤生長、增殖和轉(zhuǎn)移中有著重要作用[14-17]，在許多癌細胞中，谷氨酰胺是主要的線粒體底物，并且生成維持線粒體膜電位和完整性以及支持氧化還原大分子合成所必需的NADPH[12]。GDH是谷氨酰胺代謝途徑中的關(guān)鍵酶之一，所以GDH對于腫瘤細胞也十分重要。人體內(nèi)存在2種類型的GDH，即GDH1和GDH2，它們具有高度的序列相似性[18]。GDH1在許多組織或細胞中都有廣泛表達；而GDH2則在大腦、睪丸、胚胎組織和各種癌細胞中表達[19-20]。研究表明，GDH1主要調(diào)控癌細胞內(nèi)ɑ-酮戊二酸的生成，它通過控制細胞內(nèi)產(chǎn)物α-酮戊二酸和隨后的代謝物富馬酸鹽的水平 (富馬酸鹽結(jié)合并激活活性氧物質(zhì)清除酶谷胱甘肽過氧化物酶1)，為癌細胞增殖和腫瘤生長提供代謝優(yōu)勢。此外，GDH1在維持癌細胞氧化還原穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用[21]，通過短發(fā)夾RNA (shRNA) 或小分子抑制劑R162靶向GDH1可以導致細胞中的氧化還原穩(wěn)態(tài)失衡，從而達到阻礙癌細胞增殖和抑制腫瘤生長的目的。GDH2可以誘導增加細胞內(nèi)谷氨酸的水平，谷氨酸由氨和α-酮戊二酸合成。此外，Yukiko等發(fā)現(xiàn)在補充氨的谷氨酰胺消耗條件下，表達GLUD2 (編碼GDH2的基因) 的PC3和Hs578T細胞的增殖速率增加[14]。所以可以嘗試抑制體內(nèi)GDH的活性和表達水平來抑制腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移。

2.1 GDH與乳腺癌

乳腺癌是全球婦女最常見的癌癥之一。除皮膚癌以外，乳腺癌是目前美國婦女中最常見的癌癥，約占癌癥患者的1/3[22]。美國每年約有205 000例新增乳腺癌病例被診斷出來，其中約有4萬名病人會死于此病[23]。Jessica等研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌細胞中GDH的表達量增加，特別是雌激素受體陽性(ER+) 乳腺癌細胞與其他乳腺癌細胞亞型相比，其中的GDH表達水平上升更為顯著。他們在實驗中通過利用shRNA抑制細胞中GDH的表達水平，用15N-谷氨酰胺培養(yǎng)后對細胞進行含氮代謝物掃描，發(fā)現(xiàn)人類乳腺癌細胞主要通過GDH催化還原胺來同化氨，從而加速乳腺癌細胞的擴散[24]。Ryu等通過實驗發(fā)現(xiàn)在犬類乳腺腫瘤細胞中GDH的表達量也有一定的上升[23]。因此，特異地抑制乳腺癌細胞中的GDH表達水平及其活性可能具有抑制乳腺癌細胞增殖與擴散的潛力。

2.2 GDH與膠質(zhì)瘤

膠質(zhì)瘤 (Glioma) 是最常見的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤，約占惡性腦腫瘤的81%[25]。據(jù)統(tǒng)計每年約有22 000名美國人被診斷為惡性膠質(zhì)瘤，也是治療方案最具挑戰(zhàn)性的癌癥之一。目前對于這些原發(fā)性腦癌的治療是不充分的，大約95%的患者在確診后5年內(nèi)會死于該疾病[26]。已有研究報道谷氨酸在神經(jīng)膠質(zhì)瘤生理活動中具有許多重要的作用，例如，作為多向生長因子、空間興奮性毒素等[27]。最近的研究表明，細胞外谷氨酸濃度增加是導致80%的原發(fā)性腦腫瘤患者發(fā)生腫瘤相關(guān)性癲癇的原因[28]。Yang等通過實驗發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤細胞在葡萄糖被剝奪條件下帶來的糖酵解障礙中需要GDH才能存活[29]。Chen等發(fā)現(xiàn)GDH1和GDH2在人類異檸檬酸脫氫酶1 (Isocitrate dehydrogenase 1，IDH1) 突變型膠質(zhì)瘤IDH1R132H中的表達量呈現(xiàn)異常升高，他們分別使用sh647和sh662這兩種shRNA靶向構(gòu)建到編碼GDH的基因中 (即敲低GLUD1和GLUD2) 以確定GLUD1和GLUD2是否有助于IDH1R132H神經(jīng)膠質(zhì)瘤的生長。實驗結(jié)果顯示使用sh647后會導致GDH1/2的含量下降；使用sh662后幾乎檢測不到GDH1/2的量，最后通過實驗證明了膠質(zhì)瘤細胞生長對于GLUD1和GLUD2的依賴性，然后他們使用識別GLUD1和GLUD2的抗體對小鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤祖細胞的培養(yǎng)物進行Western blotting實驗，發(fā)現(xiàn)具有強烈的免疫性，確定GLUD2可以改善突變型IDH1的生長抑制效應[30]。

2.3 GDH與結(jié)直腸癌

結(jié)直腸癌 (Colorectal carcinoma，CRC) 是第三大常見的新型癌癥，其死亡率也排在癌癥中的第3位[31]，是死亡率較高的癌癥之一。根據(jù)相關(guān)報道，診斷為局部結(jié)直腸癌患者的5年生存率為90%，局部擴散后下降為68%，遠距離擴散后急劇下降到10%[32]。Liu等發(fā)現(xiàn)，GDH在結(jié)直腸癌細胞中的表達水平比相應的非腫瘤細胞高，GDH過度表達與結(jié)直腸癌的遷移能力和腫瘤大小有關(guān)，GDH表達水平越高，腫瘤遷移能力越強，腫瘤尺寸越大，當用shRNA抑制編碼GDH的基因后，結(jié)直腸癌細胞的增殖、遷移能力明顯下降[33]。此外，敲除GDH編碼基因后顯著減弱了STAT3 (Signal transducer and activator of transcription 3) 的磷酸化，減少了Vimentin和ZEB1的表達，同時上調(diào)了CRC細胞中E-鈣粘著蛋白的表達，他們發(fā)現(xiàn)GDH通過STAT3介導的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化 (EMT) 誘導促進CRC細胞運動性，從而對結(jié)直腸癌細胞產(chǎn)生調(diào)控作用 (圖1)。

圖1 GDH與CRC細胞運動性的關(guān)系Fig.1 Relationship between GDH and CRC cell motility.

2.4 GDH與卵巢癌

卵巢癌 (Ovarian cancer，OVCA) 是全球女性中第八大常見癌癥，2014年美國估計有21 980例新發(fā)病例和14 270例死亡病例[34]。由于缺乏特定的癥狀和充足的篩查試驗，患者常常在晚期才被診斷出來，所以卵巢癌在所有婦科惡性腫瘤中最為致命。大多數(shù)原發(fā)性卵巢惡性腫瘤來源于上皮細胞，約5%的卵巢癌來自其他類型的卵巢細胞[35]。Yuan等使用雷帕霉素處理3種卵巢癌細胞24 h后，發(fā)現(xiàn)雷帕霉素抑制了GDH活性和谷氨酰胺酶 (GLS) 的表達。此外，他們還發(fā)現(xiàn)谷氨酰胺通過調(diào)節(jié)mTOR/S6和MAPK途徑來增加GLS和GDH的活性[36]。Yang等發(fā)現(xiàn)谷氨酰胺調(diào)節(jié)STAT3的活化，STAT3是調(diào)節(jié)侵襲性卵巢癌細胞癌癥標志的信號通路的介質(zhì)。其研究結(jié)果表明，通過阻斷谷氨酰胺進入TCA循環(huán)來靶向高侵入性OVCA細胞，以及通過抑制谷氨酰胺和STAT3合成來靶向低侵入性OVCA細胞的聯(lián)合方法可能會成為OVCAs的潛在治療方法[14]。如前所述，GDH是谷氨酰胺代謝途徑的關(guān)鍵酶，提高GDH活性可以促進癌細胞的增殖和遷移，用分子靶向干預谷氨酰胺代謝可能被作為一種治療卵巢癌的有效方式。

2.5 GDH與其他類型的癌癥

2.5.1 肝癌

肝細胞癌 (Hepatocellular carcinoma，HCC)是全球第五大常見的癌癥[37]。Robert等研究發(fā)現(xiàn)，在肝病患者中，肝癌細胞的GDH活性顯著低于相鄰的正常肝細胞或肝硬化肝細胞中GDH的活性，此外，所有腫瘤細胞的總體GDH活性低于正常和肝硬化肝臟細胞活性的30%[38]。在肝細胞壞死和線粒體解體后，GDH會逸出細胞進入血液，肝癌患者的血漿GDH升高是最為明顯的，因此，測定血清中GDH活性和含量可以用作線粒體損傷和肝細胞病變診斷的指標。

2.5.2 肝外膽管癌

由于早期診斷困難，膽管癌的預后較差，隱性起病和亞臨床癥狀導致存活率低[39-40]。研究表明，新的輔助化療結(jié)合根治性膽管癌手術(shù)提高了患者的長期生存率[41]。但對于不可切除的肝外膽管癌，化療和放療均無明確療效。迄今為止，還沒有充分的證據(jù)證明化療能顯著改善外發(fā)性膽管癌患者的生存率[42]。大多數(shù)無法切除腫瘤的患者在確診后12個月內(nèi)由于惡病質(zhì)和身體狀況不佳而死亡。Su等研究表明，與正常膽管組織相比，肝外膽管癌組織中的GDH表達增加。他們發(fā)現(xiàn)沉默GDH后肝外膽管癌細胞的遷移能力顯著降低，并且能夠顯著提高肝外膽管癌細胞的凋亡率[43]。此外，GDH可能通過Smad信號通路介導的TGF-β信號傳導來促進肝外膽管癌細胞的生長和轉(zhuǎn)移。找到一種能有效抑制GDH表達水平或酶活性的方法可能具有抑制和治療肝外膽管癌的潛力。

2.5.3 肺癌

肺癌是世界上癌癥相關(guān)死亡的主要原因。肺癌可以概括地分為小細胞肺癌 (SCLC) 和非小細胞肺癌 (NSCLC) ，分別占患者人數(shù)的15%和85%[44]。根據(jù)英國國家統(tǒng)計局2014年的報告，診斷為小型局限性腫瘤的肺癌患者的1年生存率為81%–85%，而遠處轉(zhuǎn)移的肺癌患者1年生存率僅為15%–19%[44]。在Michalak等的研究中觀察到與小細胞肺癌和大細胞癌相比，鱗狀細胞肺癌患者的血清GDH活性降低，肺癌患者中的體液免疫反應與降低血清GDH活性有關(guān)[45]。所以通過谷氨酸代謝途徑治療肺癌可能具有一定的應用前景。

3 展望

GDH是谷氨酰胺代謝的關(guān)鍵酶，谷氨酰胺在GDH的作用下轉(zhuǎn)化為ɑ-酮戊二酸進入TCA循環(huán)，產(chǎn)生ATP，從而為癌細胞的生長、增殖提供能源支持。隨著研究的發(fā)展，越來越多的證據(jù)表明，GDH與腫瘤細胞的增殖、遷移、入侵等活動密切相關(guān)，在許多腫瘤細胞中都存在表達異常上升的現(xiàn)象。GDH在逐漸成為癌癥治療方面具有潛力的作用靶點，有關(guān)GDH抑制劑的篩選可能會逐漸成為研究熱點。有研究發(fā)現(xiàn)，mTOR1 (Mammalian target of rapamycin 1) 通過激活GDH促進谷氨酰胺分解從而抑制人去乙?；? (SIRT4)，進而促進腫瘤發(fā)生[46]；shRNA和小分子抑制劑R162能夠有效地抑制GDH，從而抑制腫瘤細胞的增殖、遷移等生理活動。此外，研究發(fā)現(xiàn)EGCG(Epigallocatechin gallate) 是一種典型的GDH變構(gòu)抑制劑，能明顯抑制GDH的活性，從而有效抑制腫瘤的生長和增殖[47]。越來越多的研究表明，GDH在作為癌癥治療的新靶點中有著相當?shù)臐摿?。但是，關(guān)于GDH含量變化與腫瘤發(fā)生和發(fā)展之間的病理關(guān)系尚不完全清楚，還需要更進一步的研究。我們推測，正是由于GDH與腫瘤發(fā)生的關(guān)系十分密切，有關(guān)GDH和腫瘤發(fā)生的關(guān)系研究將會是一個熱點，篩選或研制能有效針對腫瘤細胞中GDH活性的藥物也將具有巨大的開發(fā)和應用前景。