傅俊豪，楊發(fā)譽(yù)，謝海華，谷峰

溫州醫(yī)科大學(xué) 眼視光學(xué)院 眼視光學(xué)和視覺科學(xué)國家重點實驗室，浙江 溫州 325027

CRISPR作為強(qiáng)大的基因組編輯工具，目前在人類細(xì)胞[1]、植物[2-4]、動物[5-7]等真核生物中得到了很好的應(yīng)用并取得了舉世矚目的成果。但是在細(xì)菌領(lǐng)域所開展的相關(guān)研究并不多。這可能是：1) 細(xì)菌中基因操作的技術(shù)相對成熟高效；2) 在大部分細(xì)菌中不存在非同源末端連接 (Nonhomologous end joining，NHEJ) 修復(fù)機(jī)制，因此不能對Cas9蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生的DNA雙鏈斷裂進(jìn)行有效修復(fù)，使得以細(xì)菌自身內(nèi)源性基因為靶標(biāo)的DNA編輯對其造成致死性的損傷，從而限制了CRISPR/Cas技術(shù)在細(xì)菌學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用[8]。本文綜述了CRISPR/Cas系統(tǒng)作用機(jī)制，介紹了該系統(tǒng)的優(yōu)化及其在細(xì)菌領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)展，以期為細(xì)菌基因組編輯研究提供參考。

1 CRISPR/Cas系統(tǒng)的介紹

CRISPR/Cas系統(tǒng)廣泛分布于幾乎所有的古菌 (約 90%) 和多數(shù)細(xì)菌 (約 50%) 中[9]。CRISPR/Cas基因座由一系列編碼Cas蛋白的基因和一個CRISPR重復(fù)間隔序列組成[10](圖1)。典型的CRISPR重復(fù)間隔序列由一段前導(dǎo)序列、一系列短的高度保守的正向重復(fù)序列和間隔序列順序排列組成[11]。關(guān)于CRISPR/Cas系統(tǒng)的詳細(xì)分類等內(nèi)容，因為已經(jīng)有多篇相關(guān)綜述介紹，本文將不作詳細(xì)介紹，具體請參考相關(guān)文獻(xiàn)[12-13]。

細(xì)菌CRISPR/Cas系統(tǒng)在抵御外來核酸入侵時所產(chǎn)生的特異性防御過程都可大致分為3個階段：適應(yīng)階段；表達(dá)階段；干擾階段[14]。但不同類型系統(tǒng)之間也存在一定差異。以CRISPR/Cas9系統(tǒng)為例，當(dāng)外源核酸首次入侵包含CRISPR/Cas9系統(tǒng)的細(xì)菌時，在Cas1和Cas2蛋白的作用下被當(dāng)作間隔序列并整合到CRISPR陣列中的兩段重復(fù)序列之間，由此細(xì)菌對該外源序列產(chǎn)生記憶；當(dāng)再次入侵時，細(xì)菌的CRISPR免疫系統(tǒng)開始轉(zhuǎn)錄Cas9 mRNA、pre-crRNA、tracrRNA，接著tracrRNA與pre-crRNA的部分序列通過堿基互補(bǔ)配對形成復(fù)合物，Cas9蛋白穩(wěn)定復(fù)合物并與之形成復(fù)合體，再由RNase Ⅲ剪切該復(fù)合體產(chǎn)生有活性的Cas9-crRNA-tracrRNA核糖核蛋白復(fù)合物；最后成熟的crRNA與入侵的外源DNA通過堿基互補(bǔ)配對結(jié)合，再由核糖核蛋白復(fù)合物通過識別合適的PAM(Protospacer adjacent motif)序列定位切割的片段，并在Cas9的作用下將其剪切[15-16]。

2 CRISPR/Cas系統(tǒng)在細(xì)菌中的應(yīng)用

2.1 對細(xì)菌基因組的編輯

研究表明，DNA結(jié)合蛋白Ku和連接酶LigD是進(jìn)行非同源末端連接 (NHEJ) 修復(fù)必不可少的成分，但NHEJ相關(guān)蛋白僅存在于厚壁菌門、變形菌門、放線菌門等少數(shù)菌種中，因此在應(yīng)用CRISPR/Cas系統(tǒng)編輯細(xì)菌的基因組時，需要格外考慮對雙鏈切口的修復(fù)，以防止細(xì)菌的死亡[17]。在細(xì)菌中修復(fù)切口的方式包括同源重組 (Homologous recombination，HR) 修復(fù)和NHEJ修復(fù)。因此有研究者將這兩種方式聯(lián)合CRISPR/Cas系統(tǒng)對細(xì)菌的基因組進(jìn)行編輯。

2013年，Jiang等將CRISPR/Cas9技術(shù)與HR共同應(yīng)用于基因組編輯[18]。發(fā)生同源重組的細(xì)菌因Cas9不能繼續(xù)切割靶基因得以存活，未發(fā)生同源重組的細(xì)菌則被持續(xù)切割而死亡。利用同樣的策略在拜氏梭菌[19-20]、放線菌[21-24]、解纖維梭菌[25]等菌種中均能成功實現(xiàn)基因編輯。白仲虎團(tuán)隊利用相似的原理，在谷氨酸棒桿菌中引入HR修復(fù)的模板，對Cas9產(chǎn)生的DSB(Double-strand break)進(jìn)行修復(fù)，實現(xiàn)了高效的基因缺失。另外，點突變和基因插入的效率可分別達(dá)到100%和66.7%[26]。同時，孫際賓團(tuán)隊開發(fā)了一種CRISPR/Cas9介導(dǎo)的單鏈DNA (Single-stranded DNA，ssDNA)重組工程，可以在谷氨酸棒桿菌的基因組中精確地引入小的修飾和單核苷酸改變，效率超過了80.0%[27]。谷氨酸棒桿菌作為微生物細(xì)胞工廠，已被用于各種氨基酸的工業(yè)生產(chǎn)，因此這些研究為提高谷氨酸棒桿菌的生產(chǎn)力提供了工具。隨后，Penewit等在金黃色葡萄球菌中開發(fā)了重組工程和CRISPR/Cas9介導(dǎo)的反選擇條件系統(tǒng)，能夠在金黃色葡萄球菌基因組中有效和精確地設(shè)計點突變和大的單基因缺失[28]。

圖1 CRISPR基因座示意圖Fig.1 Diagram of CRISPR locus.

2014年，科學(xué)家在CRISPR系統(tǒng)中引入來自缺陷的RAC前噬菌體的RecBCD重組系統(tǒng)，在羅伊氏乳桿菌中成功地進(jìn)行基因組編輯[29]。2015年，在CRISPR系統(tǒng)中引入來自λ噬菌體的λred同源重組系統(tǒng)也成功應(yīng)用于大腸桿菌的基因組編輯中[30]。2016年，Bassalo等同樣利用λred同源重組系統(tǒng)，不僅提升了HR修復(fù)效率，而且提高了CRISPR系統(tǒng)對大腸桿菌基因組的編輯能力[31]。

除了Cas9蛋白的應(yīng)用，Cpf1蛋白也被成功地作為細(xì)菌基因組編輯的工具，如楊晟團(tuán)隊選用另一種效應(yīng)蛋白——FnCpf1 (新兇手弗朗西斯菌Francisella novicidaCpf1，也叫Cas12a)，并結(jié)合ssDNA重組系統(tǒng)，成功地構(gòu)建了抗L-脯氨酸反饋抑制的高產(chǎn)菌株[32]。

上述研究均利用了HR進(jìn)行基因組編輯，然而，用這種方法進(jìn)行編輯時，往往要經(jīng)過一個相對復(fù)雜的DNA編輯模板構(gòu)建過程，并且在大規(guī)模基因組編輯方面也會受到一定的限制。因此，有學(xué)者通過引入NHEJ相關(guān)蛋白來實現(xiàn)簡單而有效的基因組編輯。目前，利用NHEJ進(jìn)行基因組編輯的研究并不多，Tong等通過共表達(dá)Cas9蛋白和LigD蛋白，利用NHEJ途徑在鏈霉菌中實現(xiàn)了有效的基因組編輯[22]。隨后，祁慶生團(tuán)隊開發(fā)了 CRISPR-Cas9輔助的非同源末端連接(CA-NHEJ) 策略，該策略首先將Cas9以及來自結(jié)核分枝桿菌的保守型原核NHEJ相關(guān)蛋白轉(zhuǎn)入大腸桿菌，然后將sgRNA表達(dá)質(zhì)粒通過電轉(zhuǎn)方式引入宿主菌，含有導(dǎo)入的NHEJ相關(guān)蛋白的宿主菌能夠修復(fù)DSB，使其在Cas9的切割中存活，并在靶位點產(chǎn)生突變，而野生的宿主菌則被淘汰[33]。同樣，趙國屏團(tuán)隊在大腸桿菌中引入Cas9及恥垢分枝桿菌的NHEJ系統(tǒng)，實現(xiàn)了快速的基因失活或片段刪除。并且通過進(jìn)一步的設(shè)計，該系統(tǒng)可進(jìn)行連續(xù)的基因失活或DNA片段刪除[34]。因此通過引入DNA結(jié)合蛋白Ku和連接酶LigD來補(bǔ)救細(xì)菌的NHEJ修復(fù)途徑，可以有效地提升CRISPR系統(tǒng)的編輯效果。

然而，在進(jìn)行HR修復(fù)或NHEJ修復(fù)時，都是在靶基因座處引入DSB作為基因校正的第一步，這很容易導(dǎo)致不希望的突變。因此新開發(fā)的單堿基編輯系統(tǒng)很好地彌補(bǔ)了這一缺點。季泉江團(tuán)隊便把該策略引入了金黃色葡萄球菌，他們設(shè)計了 Cas9切口酶 (nCas9) 和胞苷脫氨酶(APOBEC1) 的融合體，通過過早產(chǎn)生終止密碼子使基因失活，從而在金黃色葡萄球菌中進(jìn)行快速有效的遺傳操作，加速細(xì)菌生理學(xué)的研究[35]。同時，該課題組在假單胞菌屬物種中也實現(xiàn)了高效的C→T堿基編輯[36]。劉正飛團(tuán)隊利用相似的策略在大腸桿菌中實現(xiàn)了C→T轉(zhuǎn)換[37]。鄭平團(tuán)隊、孫際賓團(tuán)隊和王猛團(tuán)隊合作，在谷氨酸棒桿菌中開發(fā)了多元自動化堿基編輯方法，同樣實現(xiàn)了C→T轉(zhuǎn)換，且進(jìn)行單、雙和三基因座編輯時，效率分別高達(dá)100%、87.2%和23.3%[38]。

2.2 CRISPR/Cas系統(tǒng)的篩選優(yōu)化

對于細(xì)菌來說，外源性基因通常指從外部引入的其他物種的DNA或人工合成的DNA。一方面，包含CRISPR/Cas系統(tǒng)的細(xì)菌，能夠利用自身內(nèi)源性的Cas蛋白對引入的外源核酸進(jìn)行特異性剪切。該過程是細(xì)菌針對噬菌體等外源物質(zhì)的入侵形成的一套適應(yīng)性免疫防御機(jī)制[15]。正是以該機(jī)制為基礎(chǔ)，經(jīng)過人工改造形成了新型的基因組編輯工具——CRISPR/Cas系統(tǒng)。

另一方面，通過引入外源CRISPR/Cas系統(tǒng)，實現(xiàn)對外源基因的剪切。該方法通常應(yīng)用于對細(xì)菌基因組的編輯，用以菌株構(gòu)建、基因功能研究以及對CRISPR/Cas系統(tǒng)的優(yōu)化[19-25]。而在對外源基因進(jìn)行編輯的應(yīng)用中，學(xué)者們通常將其作為篩選優(yōu)化的系統(tǒng)[39-40]。以下將從不同效應(yīng)蛋白篩選優(yōu)化系統(tǒng)的建立，進(jìn)一步闡述基因組編輯在該方面的應(yīng)用。

2.2.1 基于細(xì)菌的SpCas9突變體的篩選優(yōu)化

目前，使用最為廣泛的SpCas9 (釀膿鏈球菌Streptococcus pyogenesCas9) 為野生型，它主要識別的PAMs為NGG (N為A/T/C/G)，這導(dǎo)致了SpCas9的應(yīng)用僅限于包含NGG的序列[15,18]。Kleinstiver等利用基于細(xì)菌的陽性選擇試驗，篩選能夠識別新型PAMs的SpCas9突變體[39]。該實驗包含了兩種外源性質(zhì)粒：編碼誘導(dǎo)型毒性基因和靶位點的報告質(zhì)粒 (氨芐抗性)；Cas9/sgRNA的編碼質(zhì)粒 (氯霉素抗性)。將PAM相互作用域(PI) 突變的Cas9/sgRNA質(zhì)粒文庫電轉(zhuǎn)到含有報告質(zhì)粒的感受態(tài)BW25141 (λDE3) 中，經(jīng)過活化后涂布在含有誘導(dǎo)劑和氯霉素的LB固體培養(yǎng)基上，若Cas9實現(xiàn)對報告質(zhì)粒的切割，就會導(dǎo)致毒性基因的丟失，因此細(xì)菌就能存活 (表1)。存活的克隆再進(jìn)行基于人類細(xì)胞的EGFP失活試驗，最終Kleinstiver等獲得了能夠識別NGA PAMs的Cas9突變體VQR(D1135V/R1335Q/T1337R)和EQR (D1135E/R1335Q/T1337R)，以及能夠識別NGCG PAMs的Cas9突變體VRER (D1135V/G1218R/R1335E/T1337R)。

在此基礎(chǔ)上，David Liu等利用 PACE(Phage-assisted continuous evolution) 系統(tǒng)對SpCas9進(jìn)行了進(jìn)一步的篩選優(yōu)化 (表1)[40]。研究者將宿主菌液持續(xù)地流過含有 SP (Selection phages) 的反應(yīng)池，其中宿主菌含有誘導(dǎo)突變發(fā)生的質(zhì)粒MP (Mutagenesis plasmid) 和激活后能表達(dá)gene Ⅲ (噬菌體存活的必需基因) 的質(zhì)粒AP (Accessory plasmid)；SP可表達(dá)ω-dCas9 (無剪切活性的Cas9連接著細(xì)菌RNA聚合酶的ω亞基)。當(dāng)宿主菌液流過SP時，在MP的作用下引起DNA突變，由于宿主菌液的流速比宿主菌細(xì)胞分裂快，因此宿主菌不會累積突變；相反若宿主菌液的流速比SP的生命周期慢，SP就會累積突變。SP中不同的突變，就產(chǎn)生了dCas9的突變體文庫。若ω-dCas9突變體能夠識別并結(jié)合到AP(含有PAM的靶序列) 上，ω亞基就能將細(xì)菌RNA聚合酶募集到靶序列下游的geneⅢ序列前，從而誘導(dǎo)geneⅢ的表達(dá)。由于geneⅢ是噬菌體感染所必需的，因此SP上的dCas9突變體與AP上的靶序列結(jié)合的越多，geneⅢ表達(dá)越多，噬菌體就可以更多地擴(kuò)增。最終，有活性的dCas9突變體被保留下來，無活性的dCas9突變體被淘汰。David Liu等利用該策略獲得了xCas9，此突變體不僅可以識別包括NG、GAA和GAT在內(nèi)的廣泛的PAM序列，而且具有更強(qiáng)的特異性[40]。

2.2.2 基于細(xì)菌的SaCas9突變體的篩選優(yōu)化

SaCas9是一種來自金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus的Cas9酶類，其編碼序列具有比SpCas9小的特點，因此更適合用于腺相關(guān)病毒的包裝，展現(xiàn)了其在基因治療中巨大的潛力[41]。天然的SaCas9識別的PAM序列為NNGRRT (N為A/T/C/G；R為A/G)，預(yù)計在基因組上每32個堿基會出現(xiàn)一次[42]。為了拓寬SaCas9在基因組上的識別范圍，Kleinstiver等首先對SaCas9進(jìn)行改造，研究者基于其之前對SpCas9突變體的篩選，采用相同的策略，將研究方向轉(zhuǎn)向了SaCas9(表1)[42]。該實驗首先根據(jù)Cas9直系同源物的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域比對，預(yù)測了SaCas9的PI結(jié)構(gòu)域；然后對PI進(jìn)行隨機(jī)突變，構(gòu)建了SaCas9突變體文庫；再利用基于細(xì)菌的陽性選擇試驗和基于人類細(xì)胞的EGFP失活試驗確定目標(biāo)SaCas9突變體。最終研究者成功地篩選出了名為KKH SaCas9的突變體，該突變體在包含NNNRRT PAMs的人類內(nèi)源性靶位點上顯示出強(qiáng)大的基因組編輯活性，從而將SaCas9的靶向范圍提高了2–4倍。

2.2.3 基于細(xì)菌的Cpf1突變體的篩選優(yōu)化

Cpf1屬于2類Ⅴ型CRISPR效應(yīng)蛋白，與Cas9不同，Cpf1同時具有DNA和RNA內(nèi)切酶活性，因此不需要RNase Ⅲ參與對pre-crRNA的加工；此外，Cas9剪切產(chǎn)生平末端，而Cpf1剪切產(chǎn)生粘性末端，因此可促進(jìn)靶基因通過NHEJ方式插入靶位點[43]。野生型的Cpf1能識別富含胸腺嘧啶 (T) 的PAM 序列，如AsCpf1 (氨基酸球菌Acidaminococcussp.BV3L6 Cpf1) 和LbCpf1(毛螺科菌Lachnospiraceae bacteriumND2006 Cpf1)識別的PAM序列為TTTN (N為A/T/C/G)，F(xiàn)nCpf1識別的PAM序列為KYTV(K為G/T，Y為T/C，V為A/C/G)[44]。

為了進(jìn)一步提高Cpf1的靶向范圍，Gao等利用細(xì)菌篩選可以識別更多PAM的Cpf1 (AsCpf1和LbCpf1) 突變體，從而拓寬Cpf1的靶向范圍(表1)[45]。該研究首先構(gòu)建了表達(dá)crRNA和Cpf1突變體 (大部分為單個氨基酸突變) 的質(zhì)粒文庫，且質(zhì)粒上帶有氯霉素抗性基因；然后用攜帶氨芐青霉素抗性基因和帶有突變PAM的靶位點的第2個質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化，若Cpf1突變體成功識別突變的PAM且完成對靶序列的切割，就會導(dǎo)致氨芐青霉素抗性的丟失，結(jié)果菌落就不能在含有氨芐的平板上存活；最后將存活的菌株與Cpf1突變體文庫進(jìn)行比較，確定需要的突變體。Gao等利用該方法成功篩選到了RR (S542R/K607R) 和RVR (S542R/K548V/N552R) 兩種突變體，它們能分別識別TYCY和TATV(Y為T/C，V為A/C/G)PAMs，且表現(xiàn)出增強(qiáng)的活性。

表1 CRISPR/Cas系統(tǒng)篩選優(yōu)化策略Table 1 CRISPR/Cas system screening optimization strategy

2.2.4 單堿基編輯系統(tǒng)的優(yōu)化

目前，科學(xué)家們主要開發(fā)了兩種單堿基編輯系統(tǒng)。第一種可以將C·G堿基對轉(zhuǎn)變?yōu)門·A堿基對，稱為CBE (Cytidine base editing)[46-49]；第二種可以將A·T堿基對轉(zhuǎn)變?yōu)镚·C堿基對，稱為ABE (Adenine base editing)[49-52]。關(guān)于ABE對應(yīng)的腺嘌呤脫氨酶，研究人員通過定向進(jìn)化和蛋白質(zhì)工程化改造技術(shù)對來自大腸桿菌的脫氨酶TadA進(jìn)行改造，并開發(fā)了一套可以利用細(xì)菌對TadA酶進(jìn)行進(jìn)化的方法：首先修改抗生素抗性基因的關(guān)鍵位點，使得細(xì)菌抗生素抗性失效，作為一種選擇質(zhì)粒；然后構(gòu)建與dCas9融合的突變體TadA基因的質(zhì)粒文庫，只有TadA酶作用于DNA并將突變位點修正后才能使得抗生素抗性基因恢復(fù)正常功能，細(xì)菌才能存活[50]。最終，研究人員獲得了理想的脫氨酶TadA突變體。ABE目前在定點的編輯 (如壓縮到只編輯1個堿基)、編輯活性、編輯窗口 (擴(kuò)大編輯窗口) 等方面仍然需要強(qiáng)化。

2.3 對細(xì)菌基因表達(dá)的調(diào)控

對于某些高度保守且難以敲除或置換的靶基因，常?？赏ㄟ^調(diào)控基因的表達(dá)水平來達(dá)到研究的目的。其中，dCas9 (dead Cas9) 在這方面已發(fā)展為一種有效的工具。dCas9是Cas9的一種突變體，它在Cas9的兩個切割結(jié)構(gòu)域 (RuvC和HNH)產(chǎn)生點突變 (D10A和H840A)，導(dǎo)致Cas9失去對靶序列的剪切作用，但保留了與DNA的結(jié)合能力[53]。dCas9通過結(jié)合到靶基因的閱讀框內(nèi)或啟動子區(qū)，阻斷轉(zhuǎn)錄的延伸或干擾RNA聚合酶(RNAP) 與啟動子的結(jié)合，從而參與基因表達(dá)的調(diào)控[54-56]。由于具有與RNA干擾技術(shù) (RNAi) 類似的作用，因此該技術(shù)又被稱為CRISPR干擾技術(shù) (CRISPR interference，CRISPRi)[56]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，當(dāng)采用阻斷轉(zhuǎn)錄延伸的方式時，dCas9結(jié)合到非模板鏈可以達(dá)到更好的抑制效果[55-57]。目前，更多的研究是采用干擾轉(zhuǎn)錄起始的方式，當(dāng)dCas9與靶基因的啟動子結(jié)合，可競爭RNAP在其上的結(jié)合位置，從而抑制轉(zhuǎn)錄的起始。研究發(fā)現(xiàn)，采用后者方式抑制效果更為顯著[56,58]。2013年，Bikard等將dCas9應(yīng)用于肺炎鏈球菌，發(fā)現(xiàn)dCas9可將β-半乳糖苷酶的表達(dá)量下調(diào)14倍[54]。2015年，Choudhary等利用dCas9鑒定分枝桿菌中某些重要基因的功能[59]。2016年，Singh等利用dCas9抑制分枝桿菌中某些功能性基因的表達(dá)，從而觀察分枝桿菌表型上的變化[60]。2018年，Vigouroux等揭示指導(dǎo)RNA和靶標(biāo)之間的互補(bǔ)性水平控制RNA聚合酶從靶標(biāo)“踢出”dCas9并完成轉(zhuǎn)錄的速率，并且利用這種機(jī)制精確且穩(wěn)健地減少細(xì)菌基因的表達(dá)[61]。

此外，dCas9還可用于上調(diào)基因的表達(dá)。將轉(zhuǎn)錄激活因子與dCas9融合后，能夠顯著提升基因的轉(zhuǎn)錄水平。該策略已成功應(yīng)用于真核生物，但在細(xì)菌領(lǐng)域的相關(guān)報道并不多[62-66]。Bikard等將該策略應(yīng)用于大腸桿菌，實現(xiàn)了基因的激活[54]。該研究將RNA聚合酶的ω亞基分別與dCas9的C-端和N-端融合，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)融合蛋白的結(jié)合位點處于弱啟動子的轉(zhuǎn)錄起始位點上游96 nt時，對基因的激活效果最佳。2018年，Dong等在大腸桿菌中開發(fā)了一種改進(jìn)的細(xì)菌基因激活工具包[67]。他們通過CRISPR/Cas系統(tǒng)鑒定了幾種能夠有效激活基因表達(dá)的蛋白質(zhì)，最后使用最有效的激活劑SoxS，在激活一個目的基因的同時可以用CRISPRi抑制不同的靶基因，而且可以用驅(qū)動CRISPR/Cas系統(tǒng)組件的誘導(dǎo)型啟動子控制整個多基因表達(dá)過程。但相比于dCas9對基因的抑制程度，基因激活仍有很大的提升空間。

3 CRISPR/Cas系統(tǒng)總結(jié)與展望

CRISPR/Cas系統(tǒng)作為新型的第3代基因組編輯技術(shù)，與傳統(tǒng)的鋅指核酸酶 (Zinc-fingernucleases，ZFN) 技術(shù)和類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶 (Transcription activator-like effector nucleases，TALEN) 技術(shù)相比，具有省時省力、設(shè)計簡單、編輯效率高、特異性強(qiáng)、對實驗技術(shù)要求低等優(yōu)點。但是隨著深入的研究，該系統(tǒng)的缺陷也逐漸暴露，如具有較高的脫靶效應(yīng)[68-69]。因此，目前的許多研究都在致力于降低CRISPR/Cas系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)[70]。

除了脫靶效應(yīng)問題，CRISPR/Cas系統(tǒng)對PAM的需求也限制了其更為廣泛的應(yīng)用。因此，研究人員便主張對現(xiàn)有的Cas蛋白進(jìn)行改造，以擴(kuò)大其對PAM的識別范圍。如上文所訴的各類Cas蛋白突變體，均在不同程度上擴(kuò)大了野生型Cas蛋白的識別范圍。雖然目前CRISPR/Cas系統(tǒng)對PAM的需求已大大降低，但它仍有可改造的空間。

另外，相比真核生物，CRISPR/Cas系統(tǒng)在細(xì)菌及其他原核生物中的應(yīng)用比較少。細(xì)菌等原核生物缺乏NHEJ修復(fù)所需的元件，可能是制約其應(yīng)用的主要因素[8,22]?？茖W(xué)家除了通過添加NHEJ修復(fù)所需元件來降低基因組編輯的毒性外，還有學(xué)者在對藍(lán)細(xì)菌進(jìn)行基因組編輯時，發(fā)現(xiàn)FnCpf1產(chǎn)生的細(xì)胞毒性比Cas9低得多[71]。因此，在對不同種類原核生物進(jìn)行基因組編輯時，效應(yīng)蛋白的選擇可能很關(guān)鍵。同時，單堿基編輯系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)為CRISPR/Cas系統(tǒng)在細(xì)菌中的應(yīng)用提供了新的途徑。理論上，任何細(xì)菌都可以利用單堿基編輯系統(tǒng)來進(jìn)行操作。單堿基編輯系統(tǒng)的逐漸成熟將為細(xì)菌等原核生物的基因組編輯提供更大的操作空間。

對于CRISPR/Cas系統(tǒng)來說，雖然已經(jīng)取得了很多研究成果，但它仍有很大的提升空間。Cas蛋白突變體的篩選、CRISPR系統(tǒng)保真性的研究、單堿基編輯系統(tǒng)的改善、基因表達(dá)調(diào)控的應(yīng)用等都需要更深入的挖掘。另一方面，由于細(xì)菌具有經(jīng)濟(jì)、易培養(yǎng)、生長迅速等優(yōu)點，因此可以大大縮短研究周期和減少開支，展現(xiàn)了其在CRISPR系統(tǒng)研究中的巨大潛力。在不斷的探索之下，CRISPR/Cas系統(tǒng)將會發(fā)展成為更加完善的基因組編輯工具，同時也期待它能在科學(xué)研究、臨床應(yīng)用以及工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中帶來更大的突破。