羅和生， 萬一圓， 田 霞， 黃曉東

1.武漢大學(xué)人民醫(yī)院消化內(nèi)科，湖北 武漢 430060； 2.武漢大學(xué)附屬同仁醫(yī)院消化內(nèi)科

胰腺導(dǎo)管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC)是胰腺癌最常見的病理類型，占胰腺癌的80%～90%。胰腺癌是一種對人類危害極為嚴(yán)重的惡性腫瘤性疾病，隨著人們生活水平的提高，其發(fā)病率及病死率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢，5年生存率<5%。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在中國人群消化系統(tǒng)腫瘤的發(fā)病率中，胰腺癌僅占第5位(胃癌排在首位，其次是食管癌，肝癌，結(jié)直腸癌)，但病死率位居第2位，僅次于肝癌。其中，男性患病率及死亡率普遍高于女性患者[1]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類長21～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性單鏈非編碼小分子RNA，通過與目的基因mRNA的3′非編碼區(qū)(3′-untranslated region，3′UTR)的特定區(qū)域結(jié)合，從而使目的基因降解或抑制其翻譯，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)。miRNA在腫瘤中作為癌基因或抑癌基因發(fā)揮作用。據(jù)報(bào)道[2-6]，miR-20a-5p在多種腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)，包括肝癌、結(jié)腸癌、肺癌、多發(fā)性骨髓瘤等。同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)，肺癌患者血漿高表達(dá)miR-20a-5p提示較低的無病生存率(disease-free survival，DFS)及較短的生存時(shí)間(overall survival，OS)[2]。同時(shí)有文獻(xiàn)報(bào)道，在胰腺癌患者組織、血漿中均發(fā)現(xiàn)miR-20a-5p的表達(dá)升高[7-8]。以上研究均表明，miR-20a-5p可能作為癌基因參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。然而，關(guān)于其如何介導(dǎo)胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展尚無研究報(bào)道。因此，本研究通過檢測胰腺癌患者組織及胰腺癌細(xì)胞系中miR-20a-5p的表達(dá)，探索其參與胰腺癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1臨床標(biāo)本收集本研究收集16對胰腺癌組織及對應(yīng)癌旁組織標(biāo)本，癌旁組織距離癌灶邊界≥3 cm。樣本來源于2016年12月至2018年3月武漢市中心醫(yī)院肝膽胰腺外科行胰十二指腸切除術(shù)的手術(shù)患者，男10例，女6例，年齡48～65歲，平均年齡55歲。所有標(biāo)本離體后立即存放于液氮中保存。經(jīng)術(shù)后病理檢查，均確診為PDAC。本研究經(jīng)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2胰腺癌細(xì)胞株人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1、MIA PaCa-2、AsPC-1、BxPC-3、SW1990及人正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞株HPDE6-C7(H6C7)均購自美國典藏細(xì)胞庫(ATCC)。其中，PANC-1、MIA PaCa-2培養(yǎng)于DMEM高糖培養(yǎng)基，AsPC-1、BxPC-3、H6C7培養(yǎng)于RIPA 1640培養(yǎng)基，置于37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，SW1990培養(yǎng)于L-15培養(yǎng)基，置于37 ℃不含CO2培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)。所有培養(yǎng)基中均加入質(zhì)量濃度為100 g/L胎牛血清及質(zhì)量濃度為10 g/L的青-鏈霉素制成完全培養(yǎng)基。

1.3主要試劑及儀器DMEM高糖培養(yǎng)基、RIPA 1640培養(yǎng)基、L-15培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶、轉(zhuǎn)染用OPTI-MEM 培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司；miR-20a-5p及U6引物、EdU細(xì)胞增殖成像試劑盒購自廣州銳博公司；RNA提取試劑TRIzol、轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TOYOBO公司；熒光定量PCR試劑盒購自北京康為世紀(jì)公司；miR-20a-5p mimic、inhibitor及相應(yīng)對照mimic NC、inhibitor NC購自上海吉瑪公司引物(序列見表1)；CCK-8試劑盒購自日本同仁公司；Annexin V-PE/7-AAD凋亡試劑盒購自美國BD公司；熒光定量PCR擴(kuò)增儀(StepOne plus)購自美國ABI公司；熒光倒置顯微鏡購自日本OLYMPUS；流式細(xì)胞儀購自美國BD公司。

1.4qRT-PCR檢測miR-20a-5p的表達(dá)組織及細(xì)胞總RNA的提取參照TRIzol試劑說明書進(jìn)行。采用超微量紫外可見分光光度計(jì)檢測RNA純度及濃度，保證OD260/280在1.8左右，OD260/230為1.8～2.0，否則視為質(zhì)量不合格的RNA。將質(zhì)量合格的總RNA取1 μg與逆轉(zhuǎn)錄試劑及特異的miR-20a-5p逆轉(zhuǎn)錄引物(U6作為內(nèi)參)混合，在15 μl反應(yīng)體系中，37 ℃ 15 min，98 ℃ 5 min進(jìn)行逆轉(zhuǎn)。然后取4μl逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA與1 μl miRNA定量引物混合，在20 μl反應(yīng)體系中，95 ℃變性10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40個(gè)循環(huán)。U6作為內(nèi)參，miR-20a-5p的相對表達(dá)量在組織中用2-ΔCt計(jì)算，細(xì)胞系中用2-ΔΔCt(以H6C7表達(dá)量作為對照)計(jì)算。

表1 miR-20a-5p相關(guān)引物序列Tab 1 Related primer sequence of miR-20a-5p

1.5胰腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果的檢測取對數(shù)生長期的細(xì)胞AsPC-1、BxPC-3進(jìn)行鋪板，待細(xì)胞密度達(dá)80%融合后，按照Lipofectamine 2000說明書將miR-20a-5p mimic、inhibitor及相應(yīng)對照mimic NC、inhibitor NC分別轉(zhuǎn)入孔板內(nèi)，24 h后提取細(xì)胞總RNA，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，檢測轉(zhuǎn)染后胰腺癌細(xì)胞中miR-20a-5p mRNA表達(dá)水平。

1.6CCK-8檢測AsPC-1、BxPC-3細(xì)胞活力細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，將孔板內(nèi)細(xì)胞用胰酶消化下來，在倒置顯微鏡下用細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，按6 000個(gè)細(xì)胞/孔在96孔板中接種細(xì)胞懸液(100 μl/孔)，每組設(shè)5個(gè)副孔，24 h后向每孔加入CCK-8溶液10 μl(注意不要在孔內(nèi)生成氣泡)，將培養(yǎng)板置于37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h后，用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度進(jìn)行檢測，記為第1天，連續(xù)在同一時(shí)間監(jiān)測4 d。

1.7EdU檢測AsPC-1、BxPC-3細(xì)胞增殖能力細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，將孔板內(nèi)細(xì)胞用胰酶消化下來，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，按8 000個(gè)細(xì)胞/孔在96孔板中接種細(xì)胞懸液(100 μl/孔)，每組設(shè)3個(gè)副孔。24 h后棄培養(yǎng)基，向每孔加入100 μl 50 μmmol/L EdU溶液(用細(xì)胞完全培養(yǎng)基按1 000∶1稀釋EdU溶液)將培養(yǎng)板置于37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h；PBS清洗細(xì)胞1～2次后每孔加入50 μl細(xì)胞固定液(質(zhì)量濃度為40 g/L多聚甲醛的PBS)室溫孵育30 min，棄固定液；每孔加入50 μl 2 mg/ml甘氨酸，脫色搖床孵育5 min后棄去；PBS清洗細(xì)胞，每孔加入100 μl滲透劑(質(zhì)量濃度為5 g/L的TritonX-100的PBS)孵育10 min，PBS清洗1次；每孔加入100 μl的1XApollo染色反應(yīng)液，避光、室溫、脫色搖床孵育30 min，棄染色反應(yīng)液；加入100 μl滲透劑清洗2～3次，棄滲透劑；最后按100 μl/孔加入1XHoechst反應(yīng)液(用去離子水按100∶1比例稀釋)避光、室溫孵育30 min進(jìn)行DNA染色。染色完成后立即于熒光倒置顯微鏡下進(jìn)行觀測，每孔隨機(jī)取5個(gè)視野進(jìn)行拍照。

1.8細(xì)胞凋亡檢測本實(shí)驗(yàn)采用Annexin V-PE/7-AAD雙染法。將AsPC-1、BxPC-3兩種細(xì)胞分別分為NC/mimic及inNC/inhibitor各兩組。細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，將其用胰酶消化收集至EP管中，800 r/min離心5 min，收集細(xì)胞，棄培養(yǎng)基。用預(yù)冷PBS清洗細(xì)胞兩次，800 r/min離心5 min收集細(xì)胞，棄上清。將細(xì)胞重懸于500 μl 1XBinding Buffer中，依次加入1∶1的Annexin V-PE和7-AAD(各5 μl)，混勻，室溫、避光、孵育15 min，之后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測，1 h內(nèi)完成上機(jī)檢測。

2 結(jié)果

2.1胰腺癌組織及細(xì)胞系中miR-20a-5p的表達(dá)胰腺癌組織和癌旁組織中miR-20a-5p的表達(dá)量分別為10.025±5.540、4.288±1.619，兩者比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.974，P<0.01)(見圖1A)。5種胰腺癌細(xì)胞系中miR-20a-5p的表達(dá)量相較于正常胰腺細(xì)胞H6C7表達(dá)均上調(diào)(見圖1B)。

圖1 胰腺癌組織及細(xì)胞系中miR-20a-5p的表達(dá) Fig 1 Expression of miR-20a-5p in pancreatic cancer tissues and cell lines

2.2胰腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效果檢測胰腺癌細(xì)胞AsPC-1、BxPC-3根據(jù)不同處理被分為NC/mimic及inNC/inhibitor各兩組。各組均進(jìn)行qRT-PCR檢測，結(jié)果顯示，miR-20a-5p mimic組在AsPC-1、BxPC-3中表達(dá)水平均高于NC組，而miR-20a-5p inhibitor組表達(dá)水平均低于inhibitor NC組(P均<0.01)。表明胰腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-20a-5p mimic及inhibitor后分別上調(diào)及下調(diào)了miR-20a-5p的表達(dá)水平(見圖2)。

圖2 轉(zhuǎn)染miR-20a-5p模擬物及抑制劑后miR-20a-5p的表達(dá) Fig 2 Expression of miR-20a-5p in pancreatic cancer cell lines after transfecting miR-20a-5p mimic and inhibitor

2.3miR-20a-5p促進(jìn)PDAC細(xì)胞的增殖能力

2.3.1 采用CCK-8法繪制AsPC-1、BxPC-3兩種細(xì)胞生長曲線結(jié)果：在AsPC-1、BxPC-3中轉(zhuǎn)染miR-20a-5p mimic相比于轉(zhuǎn)染對照組(NC組)細(xì)胞，細(xì)胞增殖速度從第2天開始增強(qiáng)，此后在第3天和第4天，miR-20a-5p對PDAC細(xì)胞增殖速度的促進(jìn)作用逐漸得到增強(qiáng)(見圖3A、3C)。反之，轉(zhuǎn)染miR-20a-5p inhibitor相比于轉(zhuǎn)染對照組(inhibitor NC組)細(xì)胞，細(xì)胞增殖速度從第2天開始受到抑制，此后在第3天和第4天，miR-20a-5p inhibitor對PDAC細(xì)胞增殖速度的抑制作用逐漸得到增強(qiáng)(見圖3B、3D)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，在第2天、3天、第4天，過表達(dá)miR-20a-5p及抑制miR-20a-5p后與相應(yīng)對照組相比，增殖能力差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖3 過表達(dá)及抑制miR-20a-5p對胰腺癌細(xì)胞增殖活力的影響 Fig 3 Overexpression and knock down of miR-20a-5p in pancreatic cancer cells influenced proliferation activity

2.3.2 EdU細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)結(jié)果：帶藍(lán)色熒光的代表所有細(xì)胞，帶紅色熒光的代表EdU滲入正在復(fù)制的細(xì)胞，兩者疊加后通過計(jì)算紅色熒光細(xì)胞占藍(lán)色熒光細(xì)胞的比例來計(jì)算PDAC細(xì)胞增殖能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在AsPC-1、BxPC-3中轉(zhuǎn)染miR-20a-5p mimic相比于轉(zhuǎn)染對照組細(xì)胞，細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)(見圖4E)，而轉(zhuǎn)染miR-20a-5p inhibitor后細(xì)胞增殖能力明顯減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，見圖4F)。因此，過表達(dá)miR-20a-5p能夠促進(jìn)PDAC細(xì)胞增殖能力(見圖4A、4C)，而抑制miR-20a-5p能夠抑制PDAC細(xì)胞增殖(見圖4B、4D)。

2.4miR-20a-5p抑制PDAC細(xì)胞凋亡轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行上機(jī)檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在AsPC-1、BxPC-3中轉(zhuǎn)染miR-20a-5p mimic相比于轉(zhuǎn)染對照組細(xì)胞，細(xì)胞凋亡數(shù)量減少(見圖5A、5C)，而轉(zhuǎn)染miR-20a-5p inhibitor后細(xì)胞凋亡能力明顯增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖5B、5D)。提示miR-20a-5p可以抑制PDAC細(xì)胞凋亡。

3 討論

miRNA參與生命過程的諸多重要進(jìn)程，據(jù)報(bào)道，miRNA能調(diào)節(jié)人類30%的基因，其生物學(xué)功能包括參與胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖、凋亡和分化等，異常表達(dá)miRNA可能導(dǎo)致人類各種疾病的發(fā)生，其中包括腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。miRNA介導(dǎo)腫瘤發(fā)生、發(fā)展機(jī)制的研究包括扮演癌基因或抑癌基因的角色，參與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為。已有文獻(xiàn)報(bào)道，在胰腺癌患者組織、血漿中均發(fā)現(xiàn)miR-20a-5p的表達(dá)升高[7-8]。本研究通過qRT-PCR實(shí)驗(yàn)首次在胰腺癌組織及胰腺癌細(xì)胞系中證實(shí)miR-20a-5p的表達(dá)均上調(diào)，提示其可能作為癌基因參與胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展。因此，進(jìn)一步探討miR-20a-5p在胰腺癌中是否發(fā)揮生物學(xué)作用。

腫瘤細(xì)胞增殖及抗凋亡活性較正常細(xì)胞明顯升高，使得惡性腫瘤能夠無限增殖。有研究[9]發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-20a-5p能夠降低Bim及p21基因的表達(dá)水平，表明miR-20a-5p可能參與有三陰性乳腺癌增殖及凋亡等病理過程的發(fā)生。本研究通過在胰腺癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-20a-5p模擬物(miR-20a-5p mimics)及抑制劑(miR-20a-5p inhibitor)，探討過表達(dá)及敲低miR-20a-5p后對胰腺癌細(xì)胞增殖及凋亡能力的影響。通過CCK-8細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染后第2天，miR-20a-5p mimic組細(xì)胞活力較NC組明顯提高，之后第3、4天，細(xì)胞活力一直維持升高狀態(tài)。反之，miR-20a-5p inhibitor組細(xì)胞活力明顯受到抑制，且持續(xù)維持抑制狀態(tài)。同樣地，EdU實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，過表達(dá) miR-20a-5p后，細(xì)胞核DNA復(fù)制活性明顯提高。而干擾miR-20a-5p后，細(xì)胞核DNA復(fù)制活性明顯受到抑制。細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)證實(shí)，過表達(dá)miR-20a-5p能夠促進(jìn)PDAC細(xì)胞抗凋亡能力，而抑制miR-20a-5p表達(dá)能夠促進(jìn)PDAC細(xì)胞凋亡。上述實(shí)驗(yàn)表明，miR-20a-5p在胰腺癌發(fā)展過程中確實(shí)起到一定作用。

圖4 過表達(dá)及抑制miR-20a-5p對胰腺癌細(xì)胞增殖能力的影響 Fig 4 Overexpression and knock down of miR-20a-5p in pancreatic cancer cells influenced proliferation

圖5 過表達(dá)及抑制miR-20a-5p對胰腺癌細(xì)胞凋亡能力的影響 Fig 5 Overexpression and knock down of miR-20a-5p in pancreatic cancer cells influenced apoptosis

侵襲及轉(zhuǎn)移能力是惡性腫瘤區(qū)別于良性腫瘤的重要生物學(xué)特點(diǎn)，也是惡性腫瘤進(jìn)展的晚期階段。胰腺癌高侵襲，早轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)使得80%的臨床患者喪失根治性手術(shù)治療的機(jī)會，同時(shí)，由于胰腺癌治療中易發(fā)生化學(xué)耐藥，使得臨床治療胰腺癌受到極大的限制。BAI等[9]發(fā)現(xiàn)，miR-20a-5p能夠促進(jìn)三陰性乳腺癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力，而這一機(jī)制可能是通過下調(diào)RUNX3基因的表達(dá)實(shí)現(xiàn)。同時(shí)，研究還發(fā)現(xiàn)，miR-20a-5p能激活A(yù)KT及p38基因，表明miR-20a-5p可能通過MAPK/AKT信號通路介導(dǎo)宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制[10]。最近有文獻(xiàn)表明，miR-20a-5p在腫瘤細(xì)胞化學(xué)耐藥中發(fā)揮作用。miR-20a-5p通過激活NF-κB通路相關(guān)因子的表達(dá)從而促進(jìn)胃癌細(xì)胞化學(xué)耐藥，通過介導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞順鉑耐藥[11-12]?；谝陨涎芯繄?bào)道，我們還將進(jìn)一步探索miR-20a-5p如何介導(dǎo)下游相關(guān)基因參與胰腺癌發(fā)生、發(fā)展及相關(guān)機(jī)制的研究，為臨床治療胰腺癌患者提供新思路。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，miR-20a-5p在胰腺癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)均上調(diào)，并且通過促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖及抗凋亡能力參與胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展。然而，miR-20a-5p參與胰腺癌進(jìn)展的具體機(jī)制及干擾miR-20a-5p的表達(dá)后對下游信號因子或通路是否有影響等問題還有待進(jìn)一步研究。