張鐘予， 馬一杰， 鄧文英， 韓雪靈， 楊欣怡， 李 燕， 李 寧， 羅素霞

鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，河南省腫瘤醫(yī)院 1.消化內(nèi)科； 2.藥學(xué)部，河南 鄭州 450000

結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)是我國常見的消化道惡性腫瘤，與發(fā)達(dá)國家相反，在過去幾年中我國CRC發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢[1]。目前，手術(shù)切除仍是CRC患者的首選治療手段，然而對于Ⅱ/Ⅲ期和可切除Ⅳ期CRC患者，單純手術(shù)往往無法取得良好的效果，術(shù)后輔助化療地位日益重要。目前，奧沙利鉑聯(lián)合氟尿嘧啶類藥物是公認(rèn)的輔助化療方案[2]，但不同個(gè)體間在療效、不良反應(yīng)發(fā)生方面有顯著性差異。目前，從藥物基因組學(xué)角度研究患者之間藥物敏感性和預(yù)后的差異是研究的熱點(diǎn)。通過尋找具有預(yù)測價(jià)值的遺傳預(yù)測指標(biāo)，對于指導(dǎo)個(gè)體化治療、減少嚴(yán)重不良反應(yīng)發(fā)生、改善患者預(yù)后具有重要意義。

既往研究[3]表明，編碼藥物代謝酶、DNA修復(fù)酶、解毒途徑和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因存在單核苷酸多態(tài)性(SNPs),影響化療藥物在體內(nèi)的代謝過程，是導(dǎo)致個(gè)體間差異的原因之一。亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)是氟尿嘧啶類藥物體內(nèi)代謝的關(guān)鍵酶之一[4]，谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶P1(GSTP1)參與DNA修復(fù)及代謝毒物，與鉑類耐藥相關(guān)[5]，DNA錯(cuò)配修復(fù)基因3(MSH3)與鉑類藥物化療敏感性相關(guān)[6]，而多藥耐藥相關(guān)蛋白(ABCG1)作為多種藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，與多種藥物耐藥相關(guān)[7]。本文旨在通過檢測上述4個(gè)基因的多態(tài)性，探究其在接受術(shù)后輔助化療的R0切除CRC患者中的預(yù)測價(jià)值，探索潛在預(yù)測指標(biāo)，為個(gè)體化治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料收集2010年8月至2012年3月于我院行R0切除CRC患者42例，年齡23～78歲(中位年齡為54歲)，所有病例均符合：(1)經(jīng)病理學(xué)檢查確診；(2)年齡≥18歲；(3)美國東部腫瘤協(xié)作組(Eastern Cooperative Oncology Group, ECOG)體力狀況評價(jià)0～2分；(4)有足夠的骨髓功能儲備，心、肝、腎、肺等重要臟器功能正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)家族性腺癌性息肉病；(2)其他遺傳性CRC綜合征；(3)合并其他系統(tǒng)腫瘤；(4)術(shù)前行新輔助化療；(5)失訪患者。42例病例基本特征見表1。

續(xù)表1

臨床特征例數(shù)/%化療方案 mFOLFOX634(81.0) XELOX8(19.0)MTHFR-rs1801131 AA34(81.0) AC6(14.3) CC2(4.7)GSTP1-rs1695 AA28(66.7) AG10(23.8) GG4(9.5)MSH3-rs863221 TT20(47.6) TG16(38.1) GG6(14.3)ABCG1-rs425215 GG23(54.8) GC16(38.1) CC3(7.1)

1.2方法

1.2.1 治療方案：采用mFOLFOX6/XELOX方案化療。mFOLFOX6：奧沙利鉑85 mg/m2第1天靜滴；亞葉酸鈣400 mg/m2第1天靜滴；5-氟尿嘧啶400 mg/m2第1天靜推，2 400 mg/m2持續(xù)靜滴46 h 2周方案。XELOX：奧沙利鉑130 mg/m2第1天靜滴；卡培他濱850 mg/m2第1～14天口服，2次/d，3周方案。結(jié)合患者情況，給予術(shù)后輔助化療方案6～8個(gè)周期，根據(jù)化療期間出現(xiàn)的血液學(xué)及非血液學(xué)不良反應(yīng)調(diào)整用藥劑量，若出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)立即終止治療。本研究經(jīng)河南省腫瘤醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2.2 標(biāo)本采集：收集42例患者化療前靜脈血各2 ml，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，室溫靜置30 min，-80 ℃保存。

1.2.3 檢測方法：使用TIANamp Genomic DNA Kit 血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒(離心柱型，DP304)提取血液標(biāo)本基因組DNA，并嚴(yán)格按照試劑盒說明書的規(guī)定操作。采用PCR法對MTHFR-rs1801131、GSTP1-rs1695、MSH3-rs863221和ABCG1-rs425215四個(gè)基因位點(diǎn)擴(kuò)增，擴(kuò)增后產(chǎn)物使用ABI 3370XL DNA測序儀通過Sanger法對上述基因位點(diǎn)進(jìn)行等位基因分析，引物序列由北京金唯智生物科技有限公司合成并嚴(yán)格按照說明書標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行操作。設(shè)置陰性對照，部分標(biāo)本的分型結(jié)果通過酶切法進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.4 臨床療效及不良反應(yīng)評價(jià)：接受R0切除CRC患者無可測量病灶，我們通過定期復(fù)查或電話聯(lián)系對入組患者進(jìn)行隨訪，以無病生存時(shí)間(DFS)作為評估AC療效的主要指標(biāo)，以總生存期(OS)作為評估次要指標(biāo)。DFS是指從手術(shù)當(dāng)天至腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、腫瘤引起的死亡之間的時(shí)間，5年尚未復(fù)發(fā)或非腫瘤所致死亡做截尾處理者；OS是指從病理確診直至腫瘤引起的死亡或至隨訪終點(diǎn)的時(shí)間。在每周期化療前后行血液學(xué)檢驗(yàn)，并詳細(xì)詢問化療期間有關(guān)食欲、惡心、嘔吐、腹瀉和手足麻木的情況，根據(jù)NCI-CTC標(biāo)準(zhǔn)(2.0版)對患者每周期化療中所出現(xiàn)的不良反應(yīng)進(jìn)行評估并記錄。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，使用GraphPad Prism5軟件繪制圖表。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)/%表示。不同基因型與DFS和OS采用Kaplan-Meier法進(jìn)行分析，并進(jìn)行Log-Rank檢驗(yàn)?；蛐团c化療方案療效及不良反應(yīng)的關(guān)系采用χ2、Fisher確切概率法檢驗(yàn)。對DFS和OS構(gòu)建Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型校正混雜因素，進(jìn)行多因素分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1基因多態(tài)性與化療相關(guān)不良反應(yīng)的相關(guān)性分析根據(jù)NCI-CTC標(biāo)準(zhǔn)(2.0版)，54.8%的患者(23/42)在化療期出現(xiàn)Ⅱ度及以上化療相關(guān)不良反應(yīng)，Ⅲ～Ⅳ度不良反應(yīng)少見，考慮到Ⅱ度及以上不良反應(yīng)發(fā)生的普遍性和臨床相關(guān)性，本部分研究主要將Ⅱ度及以上不良反應(yīng)作為主要研究指標(biāo)。其中，血液學(xué)毒性(45.2%，19/42)是最常見的不良反應(yīng)，其次為手足麻木(周圍神經(jīng)毒性)，占40.5%(17/42)，而僅有16.7%(7/42)的患者發(fā)生Ⅱ度及以上胃腸道不良反應(yīng)。

通過χ2檢驗(yàn)對基因型與不良反應(yīng)發(fā)生率進(jìn)行的關(guān)聯(lián)性分析(見表2)，我們發(fā)現(xiàn)， GSTP1-rs1695的多態(tài)性與消化道不良反應(yīng)發(fā)生率有顯著相關(guān)性：GSTP1-rs1695 AA型發(fā)生Ⅱ度及以上消化道不良反應(yīng)的概率顯著高于突變型(AG/GG型)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(25.0%和0，P=0.040)。其他3個(gè)位點(diǎn)基因型與不良反應(yīng)發(fā)生率之間無顯著相關(guān)性(P>0.05)。

表2 CRC患者SNPs與Ⅱ度以上不良反應(yīng)之間的相關(guān)性分析

2.2基因多態(tài)性與術(shù)后輔助化療療效分析入組患者的中位隨訪時(shí)間為33.6個(gè)月(2.2～60個(gè)月)。隨訪結(jié)束時(shí)，10例(23.8%)患者無復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，31例(73.8)患者仍存活，7例(16.7%)死于CRC，4例(9.5%)失訪。

通過K-M生存分析不同位點(diǎn)各基因型與DFS和OS進(jìn)行的相關(guān)性，將結(jié)果總結(jié)在表3和圖1、2中。基于K-M分析，MTHFR-rs1801131的野生型(AA)與突變型(AC/CC)在DFS和OS上比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，AC/CC型患者的DFS和OS顯著短于AA型患者(6.5個(gè)月vs25個(gè)月，P=0.012；15.2個(gè)月vs44.7個(gè)月，P=0.010)。存在GSTP1-rs1695突變(AG/GG)的患者較野生型(AA)患者的DFS短，但差異僅達(dá)邊緣統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(25.0個(gè)月vs12.7個(gè)月，P=0.087)。然而，在MSH3-rs863221、ABCG1-rs425215兩個(gè)位點(diǎn)，基因型分布與生存之間無明顯相關(guān)性。

此外，本研究通過構(gòu)建Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型校正混雜因素，進(jìn)行多因素分析(見表4)。經(jīng)單因素分析發(fā)現(xiàn),病理分期對患者生存有影響(P=0.037),因此將病理分期和MTHFR-rs1801131納入模型。經(jīng)校正，MTHFR-rs1801131對DFS和OS獨(dú)立的影響意義仍存在，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)?？梢哉J(rèn)為，MTHFR-rs1801131 A>C突變是對R0切除CRC患者接受標(biāo)準(zhǔn)術(shù)后輔助化療預(yù)后判斷的獨(dú)立預(yù)測因子。

表3 CRC患者SNPs與預(yù)后的相關(guān)性分析

圖1 不同基因型CRC患者術(shù)后DFS比較;圖2 不同基因型CRC患者術(shù)后OS比較Fig 1 Comparison of DFS patients with different genotypes of CRC; Fig 2 Comparison of OS patients with different genotypes of CRC

因素DFSOS單因素分析P值多因素分析P值RR(95% CI)單因素分析P值多因素分析P值RR(95% CI)性別0.375——0.502——化療方案0.185——0.069——年齡0.306——0.493——病理分期0.0370.1151.84(0.861～3.953)<0.001 0.0402.540(1.044～6.177)部位0.438——0.386——MTHFR A>C0.0120.013a3.426(1.128～9.046)0.0100.007a3.385(1.389～8.253)

注：DFS；無病生存期；OS；總生存期；CI：置信區(qū)間；RR：風(fēng)險(xiǎn)比；a:校正分期。

3 討論

在R0切除的Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ期CRC患者中，很大比例將會出現(xiàn)術(shù)后原位復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。術(shù)后早期行輔助化療是消滅微小病灶、是保證療效、延長DFS、提高治愈率的重要治療手段。目前，奧沙利鉑聯(lián)合氟尿嘧啶類藥物是公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)輔助化療方案，而臨床上發(fā)現(xiàn)相同病理類型的患者接受相同的化療方案，患者不良反應(yīng)的發(fā)生率和預(yù)后相差很大，該現(xiàn)象無法完全用年齡、性別、病理分期解釋。隨著藥物基因組學(xué)的發(fā)展，人們逐漸認(rèn)識到相關(guān)藥物代謝相關(guān)酶基因多態(tài)性是該現(xiàn)象的根本原因之一[3]?；蚨鄳B(tài)性包括DNA片段長度多態(tài)性、DNA重復(fù)序列多態(tài)性和單核苷酸多態(tài)性，其中最主要的是SNPs。通過檢測藥物代謝相關(guān)基因SNPs，可以預(yù)測術(shù)后輔助化療療效和不良反應(yīng)的發(fā)生情況，為個(gè)體化治療提供理論依據(jù)。目前，絕大多數(shù)關(guān)于SNPs與CRC的研究局限于不同基因型與發(fā)病之間的關(guān)系及其與晚期CRC化療療效之間關(guān)聯(lián)的研究，關(guān)于SNPs在術(shù)后輔助化療中的臨床意義研究較少，且爭議較大[8-9]。本研究通過對尚存爭議和研究較少的4個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行分析，結(jié)果驗(yàn)證了MTHFR-rs1801131和GSTP1-rs1695多態(tài)性在接受術(shù)后輔助化療的CRC患者中具有預(yù)測價(jià)值。

5-FU是消化道惡性腫瘤最基礎(chǔ)和常用的化療藥物，在此基礎(chǔ)上研發(fā)出了口服氟尿嘧啶前藥卡培他濱、替吉奧，這些藥物均可在體內(nèi)轉(zhuǎn)化代謝為5-FU從而發(fā)揮療效。5-FU在體內(nèi)經(jīng)一系列酶促反應(yīng)轉(zhuǎn)化為活性代謝產(chǎn)物5-氟尿嘧啶脫氧核昔(FdUMP)，F(xiàn)dUMP在輔因子5，10-亞甲基四氫葉酸(CH2FH4)的存在下，能與胸苷酸合酶(TS)結(jié)合形成等價(jià)的三連復(fù)合物TS-FdUMP-CH2FH4，影響TS與dUMP的結(jié)合，使TS失去催化活性，從而抑制了dTMP的合成，使DNA合成受限，導(dǎo)致細(xì)胞生長受到抑制甚至死亡，達(dá)到減滅癌細(xì)胞的目的[10]。MTHFR是5-FU體內(nèi)代謝過程中的關(guān)鍵酶之一，MTHFR-rs1801133和MTHFR-rs-1801131是常見的突變位點(diǎn)，基礎(chǔ)研究結(jié)果認(rèn)為該兩位點(diǎn)突變與MTHFR酶活性下降有關(guān)，導(dǎo)致葉酸代謝障礙，使5，10-亞甲基四氫葉酸積聚，可能會增加5-FU利用度[11]。本研究結(jié)果提示，MTHFR-rs1801131突變型是R0切除術(shù)后接受標(biāo)準(zhǔn)輔助化療預(yù)后差的獨(dú)立預(yù)測因素，但該位點(diǎn)多態(tài)性與化療相關(guān)不良反應(yīng)的發(fā)生率之間無明顯相關(guān)性。CECCHIN等[12]研究發(fā)現(xiàn)，相較于MTHFR-rs1801131AA+AC型，CC型患者有較差的預(yù)后,這與我們的研究結(jié)果相一致；然而也有部分研究與本研究結(jié)果相反，如NAHID等[13]研究表明，MTHFR-rs1801131多態(tài)性與化療預(yù)后無確切關(guān)聯(lián)。

奧沙利鉑是第3代鉑類化療藥，在體內(nèi)通過與細(xì)胞DNA結(jié)合，形成Pt-DNA復(fù)合物，干擾DNA的功能，從而發(fā)揮抗腫瘤作用[14]。GSTP1是體內(nèi)谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的(GSTS)亞型之一，具有促DNA修復(fù)作用，且與化療藥物代謝有關(guān)。GSTP1-rs1695位點(diǎn)的腺嘌呤A突變成鳥嘌呤G，導(dǎo)致第105位密碼子編碼的氨基酸由異亮氨酸變?yōu)槔i氨酸，使GSTP1修復(fù)DNA損傷酶活性降低及奧沙利鉑排泄速率降低。據(jù)此我們猜想存在GSTP1-rs1695突變的患者可能對輔助化療反應(yīng)更佳，而發(fā)生化療相關(guān)不良反應(yīng)率更高。然而，與我們推測相反的是，本研究中我們發(fā)現(xiàn)，GSTP1-rs1695野生型患者的Ⅱ度及以上胃腸道不良反應(yīng)發(fā)生率遠(yuǎn)高于突變型型，與YUAN等[15]的研究結(jié)果相一致。目前，GSTP1突變與化療敏感性、預(yù)后的關(guān)系暫無定論，HOLLEY等[16]研究發(fā)現(xiàn)，接受mFOLFOX6化療的329例CRC患者，GSTP1突變與預(yù)后無關(guān)，這與我們的結(jié)果相似。而KUMAMOTO[17]研究表明，GSTP1 AG/GG基因型較AA型對FOLFOX敏感性高。

MSH3是一種DNA錯(cuò)配修復(fù)蛋白，MSH3和MSH2形成的異源二聚體MutSβ，一方面參與識別DNA鏈的核苷酸錯(cuò)配修復(fù)，在維持基因組完整性和穩(wěn)定性方面具有重要作用。另一方面，MutSβ參與了識別修復(fù)DNA-DNA鏈間交鏈結(jié)構(gòu)(ICLs)，這一結(jié)構(gòu)形成是化療藥物如順鉑作用腫瘤細(xì)胞的重要機(jī)制[18]。ABCG1是多藥耐藥相關(guān)蛋白，是一類ATP能量依賴型跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，是具有選擇性和特異性的藥物外排泵，與多種藥物耐藥相關(guān)[7]。LIU等[6]發(fā)現(xiàn)MSH3部分位點(diǎn)與鉑類藥物不良反應(yīng)相關(guān)；WANG等[19]對1 185例非小細(xì)胞肺癌患者進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，ABCG1部分位點(diǎn)與預(yù)后相關(guān)。在本研究中，MSH3-rs863221及ABCG1-rs425125 多態(tài)性與化療不良反應(yīng)的發(fā)生及預(yù)后無明顯相關(guān)性。

本研究結(jié)果提示，MTHFR-rs1801131和GSTP1-rs1695多態(tài)性在接受術(shù)后輔助化療的CRC患者中具有預(yù)測價(jià)值，可能作為R0切切除CRC患者術(shù)后輔助化療的獨(dú)立預(yù)測指標(biāo)，用于指導(dǎo)個(gè)體化用藥。然而，本研究有部分局限性，樣本量較小，可能存在偏移，應(yīng)擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究。