王許平， 王素敏， 孫亞星， 耿 麗， 王丹丹， 楊貝貝， 杜曉博， 高 闖， 馮百歲

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，河南 鄭州 450014

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)主要包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)和克羅恩病(Crohn’s disease, CD)，是一組病因不明的胃腸道慢性反復(fù)發(fā)作性疾病，目前普遍認(rèn)為其與遺傳、環(huán)境、微生物及宿主的免疫因素相關(guān)，主要特征是機(jī)體免疫功能紊亂所致的不恰當(dāng)?shù)拿庖叻磻?yīng)，從而造成組織損傷，而細(xì)胞和細(xì)胞因子之間的相互作用驅(qū)動(dòng)了炎性途徑和組織損傷[1-3]。白細(xì)胞介素34(interleukin-34,IL-34)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新型的細(xì)胞因子，可結(jié)合單核細(xì)胞及巨噬細(xì)胞表面的集落刺激因子受體(CSF-1R),促進(jìn)巨噬細(xì)胞的增殖、分化，也有研究[4]表明，它能夠促進(jìn)多種促炎細(xì)胞因子及趨化因子的分泌，如IL-6、IL-8、CCL20等，引起一系列炎癥反應(yīng)。本研究檢測了IBD患者結(jié)腸組織與血清中IL-34的表達(dá)，并分析其與臨床指標(biāo)及疾病嚴(yán)重程度的關(guān)系，旨在探討其在疾病中的意義。

1 資料與方法

1.1一般資料選擇鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院2017年1月至2018年7月門診和住院的活動(dòng)期IBD患者69例，所有患者均符合2018年中華醫(yī)學(xué)會(huì)消化病學(xué)分會(huì)炎癥性腸病學(xué)組制定的UC與CD診斷標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)估UC的活動(dòng)性采用改良的Mayo評(píng)分系統(tǒng)，評(píng)估CD的活動(dòng)度采用Best克羅恩病活動(dòng)指數(shù)計(jì)算法[5]。共納入U(xiǎn)C患者48例，男26例，女22例，年齡(44.9±15.3)歲(17～82歲)，其中，緩解期患者9例，輕度患者11例，中-重度患者28例；CD患者21例，男12例，女9例，年齡(41.9±17.3)歲(15～72歲)，其中，緩解期患者6例，輕度患者6例，中-重度患者9例。24例結(jié)腸組織對(duì)照組為結(jié)腸癌行外科手術(shù)切除的癌旁組織(癌旁對(duì)照組)，均經(jīng)病理證實(shí)，男14例，女10例，年齡(37.6±10.2)歲(25～54歲)。29名健康志愿者為血清對(duì)照組(正常對(duì)照組),男13名，女16名，年齡(42.5±10.7)歲(25～70歲)。所有對(duì)象排除合并其他自身免疫性疾病、惡性腫瘤及其他急慢性感染性疾病。研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2IBD患者臨床資料的收集記錄IBD患者血清ESR及CRP數(shù)據(jù)。

1.3結(jié)腸組織中IL-34的表達(dá)采用免疫組織化學(xué)法測定。取石蠟切片置于60 ℃烘箱中烘烤60 min；二甲苯脫蠟；梯度乙醇水化；抗原修復(fù)；滅火內(nèi)源性過氧化物酶；加山羊血清封閉液；滴加兔抗人IL-34多克隆抗體(博奧森生物技術(shù)有限公司)(稀釋度為1∶600)；加生物素標(biāo)記二抗，酶標(biāo)鏈親和復(fù)合物；DAB顯色；蘇木素復(fù)染；鹽酸乙醇分化；各步驟之間用PBS沖洗3次，每次5 min，最后脫水封片。嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行各步驟操作。免疫組織化學(xué)結(jié)果判斷：陽性細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色的顆粒，根據(jù)染色的廣度和強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分。在光學(xué)顯微鏡400倍下閱片，選擇無邊緣效應(yīng)、無組織折疊等影響讀片效果的典型部位，隨機(jī)選取5個(gè)不重復(fù)視野，取每個(gè)視野內(nèi)的平均陽性細(xì)胞數(shù)作為計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)，每個(gè)切片分別由兩名病理科醫(yī)師計(jì)數(shù)，在雙盲下行結(jié)果評(píng)分判斷，計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，陽性所占百分比：0～5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，≥76%為4分。染色強(qiáng)度：無色為0分，淡黃色為1分，棕色或棕黃色為2分，棕褐色或褐色為3分。以上兩項(xiàng)得分之和<3分為陰性，≥3分為陽性。

1.4血清IL-34水平檢測所有研究對(duì)象清晨空腹,采集外周靜脈血3 ml,抽血后速離心,離心率3 000 r/min,離心15 min收集血清,于-80 ℃保存待測,實(shí)驗(yàn)前于室溫變?nèi)诤笫褂?血清中IL-34的檢測采用武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司生產(chǎn)的雙抗體夾心ELISA法檢測試劑盒,嚴(yán)格按照說明書操作。

1.5觀察指標(biāo)記錄研究對(duì)象結(jié)腸組織和血清中IL-34的表達(dá)，外周血ESR及CRP表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1IBD患者與正常對(duì)照組血清IL-34表達(dá)水平的比較UC活動(dòng)期和CD活動(dòng)期血清IL-34的表達(dá)均高于正常對(duì)照組，而UC緩解期和CD緩解期與正常對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。中-重度UC和CD患者血清IL-34分別高于輕度UC和CD患者。

表1 各組血清IL-34的表達(dá)Tab 1 Serum expression of IL-34 in each group

注：F=38.762，P<0.05；與正常對(duì)照組相比，aP>0.05；與緩解期相比，bP<0.05; 與輕度相比，cP<0.05。

2.2血清IL-34與疾病活動(dòng)度之間的關(guān)系在UC活動(dòng)期患者中，血清IL-34的表達(dá)水平與疾病活動(dòng)度呈正相關(guān)(r=0.666,P=0.000)，在CD活動(dòng)期中，血清IL-34的表達(dá)水平與疾病活動(dòng)度呈正相關(guān)(r=0.768，P=0.000)。

2.3血清IL-34與疾病活動(dòng)指標(biāo)的關(guān)系在CD活動(dòng)期患者中，血清IL-34與CRP(r=0.732，P=0.002)及ESR(r=0.564，P=0.028)均呈正相關(guān)。同時(shí)，在UC活動(dòng)期患者中IL-34與CRP(r=0.673，P=0.000)及ESR(r=0.550，P=0.000)也呈正相關(guān)(見圖1)。

圖1 患者血清IL-34與CRP及ESR相關(guān)性分析 A～B：CD活動(dòng)期組;C～D：UC活動(dòng)期組 Fig 1 The correlation analysis of serum of patients between IL-34 and CRP and ESR A-B: active CD group;

2.4各組結(jié)腸組織中IL-34的表達(dá)癌旁組織對(duì)照組、CD緩解期組、UC緩解期組、CD活動(dòng)期組和UC活動(dòng)期組結(jié)腸組織中IL-34表達(dá)的陽性率分別為16.7%(4/24)、33.3%(2/6)、22.2%(2/9)、73.3%(11/15)、66.7%(26/39)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.911，P=0.030)，UC活動(dòng)期和CD活動(dòng)期分別與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；UC緩解期和CD緩解期與對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；UC活動(dòng)期和UC緩解期相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；CD活動(dòng)期和CD緩解期相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.088)；UC活動(dòng)期和CD活動(dòng)期相比，UC緩解期和CD緩解期相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見圖2)。

圖2各組結(jié)腸組織中IL-34的表達(dá)(400×)

A：癌旁組織對(duì)照組;B：CD活動(dòng)期組;C：UC活動(dòng)期組;D：CD緩解期組;E：UC緩解期組

Fig2ExpressionofIL-34ineachcolontissuegroup(400×)

A:control group; B: active CD group;C: active UC group; D: paracmastic CD group; E: paracmastic UC group

3 討論

IBD是胃腸道慢性反復(fù)發(fā)作性疾病，病因尚不清楚，目前普遍認(rèn)為與遺傳、宿主免疫及環(huán)境因素有關(guān)。其中，腸黏膜免疫異常是重要的病因之一，在免疫應(yīng)答過程中促炎因子與抑制性細(xì)胞因子的表達(dá)失衡在IBD的發(fā)病機(jī)制中具有重要作用[6-7]。IL-34是一種新型的細(xì)胞因子，與多種免疫及炎癥性疾病相關(guān)，而IL-34在IBD的研究中仍較少。

本研究結(jié)果顯示，UC活動(dòng)期組、CD活動(dòng)期組、UC緩解期組、CD緩解期組、正常對(duì)照組血清中IL-34的濃度分別為(61.26±17.17)pg/ml、(67.64±16.72)pg/ml、(29.12±7.15)pg/ml、(30.46±6.31)pg/ml、(26.43±7.14)pg/ml。在活動(dòng)期IBD患者中血清IL-34的水平明顯高于緩解期及對(duì)照組，且中-重度患者血清IL-34水平高于輕度，與疾病活動(dòng)度呈正相關(guān)。同時(shí)，在活動(dòng)期UC和CD患者中血清IL-34與臨床疾病活動(dòng)指標(biāo)CRP及ESR呈正相關(guān)。進(jìn)一步在結(jié)腸組織中，我們發(fā)現(xiàn)活動(dòng)期UC及活動(dòng)期CD患者IL-34的表達(dá)高于癌旁組織對(duì)照組，其中活動(dòng)期UC高于緩解期UC，但在CD患者中，活動(dòng)期雖然高于緩解期，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，考慮可能與樣本量小有關(guān)。IL-34在組織中的作用及其作用機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。

IL-34由單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肝細(xì)胞和上皮細(xì)胞等分泌，并且持續(xù)高表達(dá)于心臟、腦、肝臟、小腸和結(jié)腸等器官組織中。它是CSF-1R的第二配體，能夠與M-CSF共同激活CSF-1R，它與前者具有相似的功能，但具有不同的特征和信號(hào)模式，對(duì)CSF-1R的激活作用更強(qiáng)。而在IBD中炎癥部位常伴有大量單核/巨噬細(xì)胞的浸潤，這些細(xì)胞對(duì)炎癥刺激產(chǎn)生反應(yīng)，進(jìn)一步刺激增強(qiáng)細(xì)胞因子及趨化因子的產(chǎn)生[4,8-9]。研究表明，在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合征等多種炎癥相關(guān)的疾病中，IL-34與一些炎癥指標(biāo)及疾病活動(dòng)度均表現(xiàn)出一定的相關(guān)性[4]。近年來，越來越多的研究表明，IL-34與炎癥途徑密切相關(guān)，參與并促進(jìn)了炎癥性疾病的發(fā)生、發(fā)展。TRUONG 等[10]發(fā)現(xiàn)，在雞的細(xì)胞系中，IL-34可與CSF-1R結(jié)合，從而激活JAK2/STAT、NF-κB和絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)傳導(dǎo)途徑，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的表達(dá)，可檢測到TNF、Th1(IFN、IL-1β)型和Th17型(IL-12p40、IL-17A、IL-17D)細(xì)胞因子的表達(dá)明顯增加。在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中，與對(duì)照組相比，患者血清IL-34、IL-6、IL-8、TNF-α的水平明顯增高，且IL-34與IL-6、IL-8、TNF-α及疾病活動(dòng)度呈正相關(guān)。而在接受治療期間，IL-34水平顯著下降，同時(shí)伴ESR、CRP等炎性指標(biāo)的下降[11]。ZWICKER 等[12]發(fā)現(xiàn)，IBD患者結(jié)腸炎癥部位中IL-34 mRNA表達(dá)明顯高于非炎癥部位，進(jìn)一步在Caco2細(xì)胞中進(jìn)行的研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α可通過增加NF-κB而使IL-34的表達(dá)增強(qiáng)。在DSS誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠模型中同樣檢測到IL-34 mRNA表達(dá)較正常對(duì)照組明顯上調(diào)。我們的研究同樣發(fā)現(xiàn)，在UC和CD患者中IL-34的表達(dá)均明顯高于對(duì)照組，兩者之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，IL-34在結(jié)腸上皮及固有層中均有較明顯的表達(dá)，結(jié)合前人的研究，IL-34在炎癥途徑中具有重要作用，而IBD的發(fā)生、發(fā)展中免疫功能的紊亂及過激的炎癥反應(yīng)為其重要的特征，IL-34或許可以作為未來IBD治療的靶標(biāo)。同時(shí)，活動(dòng)期UC與CD患者血清中IL-34水平的明顯增加，并與疾病嚴(yán)重程度和疾病活動(dòng)指標(biāo)呈正相關(guān)，預(yù)示它或許可以作為該疾病活動(dòng)度的標(biāo)志物。

綜上，IL-34在IBD患者血清及腸組織中表達(dá)增加，提示可能參與了IBD的發(fā)生、發(fā)展，有望成為新的治療靶點(diǎn)和生物標(biāo)志物。