肖 璇， 楊偉超， 杜蓓蓓， 徐 慧*， 趙臨襄

(1.沈陽藥科大學(xué) 制藥工程學(xué)院，遼寧 本溪 117004；2.中國科學(xué)院 沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所 污染生態(tài)與環(huán)境工程重點實驗室，遼寧 沈陽 110016)

蟲草素(Cordycepin)，又名3′-脫氧腺苷(3′-Deoxyadenosine)，分子式為C10H13N5O3。蟲草素是蛹蟲草中的主要活性成分，也是從真菌中提取分離出來的第一個核苷類抗菌素[1]。蟲草素具有抗菌、抗病毒、干擾人體RNA和DNA合成及顯著抑制多種腫瘤細胞生長的作用[2-4]。此外，蟲草素還有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗衰老、擴張支氣管等藥理作用[5-6]。人們通常通過食用冬蟲夏草(或蛹蟲草)來達到保健及治療的目的，而作為蟲草核心功能成分的蟲草素在人體腸道中的代謝機理尚不清楚。大量研究表明，中藥中的某些化學(xué)成分可經(jīng)腸道菌群代謝或轉(zhuǎn)化，進而形成新的活性成分被人體吸收利用。楊秀偉等[7]發(fā)現(xiàn)，羅漢果皂苷Ⅲ經(jīng)人體腸道內(nèi)細菌轉(zhuǎn)化后生成羅漢果皂苷ⅡA1和羅漢果醇，進而在體內(nèi)體現(xiàn)出生物學(xué)活性。劉鐵漢等[8]發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷易被腸道內(nèi)菌叢代謝。因此，推測蟲草素極有可能被腸道菌群代謝或轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生新的化學(xué)成分進入人體從而發(fā)揮作用。干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)屬于乳桿菌屬(Lactobacillus)，是一種重要的腸道益生菌。L.casei廣泛存在于食物與腸道中，因其能夠耐受有機體的防御機制，包括口腔中的酶、胃液中低pH值和小腸的膽汁酸等，所以L.casei可以在人體腸道內(nèi)大量定殖。越來越多的研究證實，乳桿菌不僅能夠調(diào)節(jié)機體胃腸道正常菌群，保持腸道微生態(tài)平衡，提高食物消化率和生物效價，還能夠抑制腸道內(nèi)腐敗菌的生長繁殖和有害代謝物的產(chǎn)生[9-10]。L.casei的上述功效使得以其為主要成分制成的系列產(chǎn)品(如食品、飲料、保健品等)深受廣大消費者青睞，市場需求量巨大。近年來，以蟲草與L.casei復(fù)合發(fā)酵形成的新食品與保健品相繼出現(xiàn)[11-12]，開辟了蟲草功能食品的新領(lǐng)域。然而，L.casei對蟲草素是否有代謝，代謝后的產(chǎn)物對人體健康是否有影響，是目前蟲草的生物活性機理研究和新產(chǎn)品開發(fā)過程中亟待解決的關(guān)鍵問題。為了闡明L.casei對蟲草素的生物轉(zhuǎn)化過程，本研究采用厭氧培養(yǎng)的方法對L.casei生物轉(zhuǎn)化蟲草素的過程進行了研究，為進一步研究腸道菌對蟲草素的生物轉(zhuǎn)化機制以及蟲草素的藥理作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)，保存于中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所環(huán)境微生物組。

1.1.2 藥品與試劑 MRS培養(yǎng)基，蟲草素(上海源葉生物，純度≥98%)。

1.1.3 儀器 隔水式恒溫培養(yǎng)箱(GNP-9080型)；厭氧袋，厭氧產(chǎn)氣包(2.5 L，海博生物)；高效液相色譜(Younglin YL9100型)；戴安半制備液相色譜儀(DIONEX UltiMate3000型)；液質(zhì)聯(lián)用儀(色譜系統(tǒng)：Thermo Accela高效液相色譜系統(tǒng)；質(zhì)譜系統(tǒng)：Thermo TSQ Quantum Access Max 三重四極桿質(zhì)譜系統(tǒng))；核磁共振波譜儀(Bruker-AV-600型)。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌對蟲草素的生物轉(zhuǎn)化 ①L.casei菌體制備：取干酪乳桿菌種液，按5%(體積分數(shù)) 接種量接種至MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h。菌液于6 000 r/min離心10 min，去掉上清，菌體沉淀用無菌生理鹽水洗3次(6 000 r/min×10 min)后于4 ℃保存?zhèn)溆?。②L.casei對蟲草素的生物轉(zhuǎn)化：50 mg蟲草素溶解于200 mL純凈水中，終濃度為0.996 mmol/L。將2 gL.casei(活菌數(shù)為3.6×109cfu/g)菌體轉(zhuǎn)移至上述蟲草素溶液中，混勻。對照組不接入L.casei，于37 ℃厭氧培養(yǎng)72 h。定時取樣以HPLC法測定不同培養(yǎng)時間蟲草素和代謝物，根據(jù)標準曲線計算對應(yīng)的蟲草素濃度。

1.2.2 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的HPLC檢測 將不同培養(yǎng)時間的培養(yǎng)液分別經(jīng)0.22 μm的無菌濾膜過濾，收集濾液，用YL9100型高效液相色譜儀對代謝物進行檢測。HPLC色譜條件：Welch Ultimate?AQ-C18, 5 μm, 4.6 mm×250 mm色譜柱，柱溫35 ℃，流動相為8%乙腈，UV 260 nm，流速1 mL/min，進樣量5 μL。

1.2.3 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的LC-MS分析 利用LC-MS設(shè)備對濾液進行檢測。①液相色譜條件：Welch Ultimate? AQ-C18，5 μm，4.6 mm×250 mm色譜柱，流動相為8%乙腈，UV 260 nm，流速為0.8 mL/min。②質(zhì)譜條件：離子源為ESI源，噴霧電壓3 500 V，離子源溫度270 ℃，霧化氣壓30 psi，輔助氣壓10 psi，毛細管溫度320 ℃，質(zhì)量掃描范圍50.00 ～ 500.0 m/z。

1.2.4 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物純品制備與數(shù)據(jù)分析 轉(zhuǎn)化后溶液中的新產(chǎn)物經(jīng)戴安半制備液相分離純化，凍干，-20 ℃保存。半制備液相色譜條件：YMC-Pack ODS-A，5 μm，10 mm×250 mm色譜柱，流動相為8%乙腈，UV 260 nm，流速為2 mL/min。

1.2.5 蟲草素與轉(zhuǎn)化后產(chǎn)物的定量分析 取蟲草素標準品與轉(zhuǎn)化后新產(chǎn)物純品，分別配成0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 mg/mL溶液，經(jīng)HPLC(色譜條件同1.2.3)進行檢測，以峰面積為縱坐標繪制標準曲線，并根據(jù)標準曲線計算對應(yīng)濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC檢測與產(chǎn)物含量分析

HPLC檢測結(jié)果顯示，蟲草素標準品的保留時間為8.45 min(圖1)。蟲草素經(jīng)由L.casei轉(zhuǎn)化后，在保留4.95 min時得到一個新產(chǎn)物(圖2)，標記為CA。轉(zhuǎn)化產(chǎn)物CA經(jīng)半制備液相分離純化，得到26 mg白色粉末狀純品。通過峰面積與濃度繪制標準曲線圖(圖3)，擬合方程：蟲草素，Y=21 520X+34.328，R2=0.997 3；CA，Y=21 980X+24.974，R2=0.996 4。

圖1 蟲草素標準品的HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatogram of the cordycepin

圖2 蟲草素被L. casei轉(zhuǎn)化后產(chǎn)物CA的HPLC圖譜Fig.2 HPLC chromatograms of the bio-transformed product CA

圖3 蟲草素與產(chǎn)物CA標準曲線Fig.3 Standard curves of the cordycepin and the CAA

L.casei對蟲草素進行生物轉(zhuǎn)化的時間動態(tài)測定，每12 h取樣一次，由HPLC法測定蟲草素和CA，根據(jù)標準曲線計算轉(zhuǎn)化后的溶液中蟲草素和CA濃度與未添加L.casei的對照組蟲草素濃度，結(jié)果如圖4所示。隨培養(yǎng)時間延長，蟲草素含量逐漸降低，CA含量不斷上升，24～ 48 h的轉(zhuǎn)化效率最高，72 h時CA含量最高，為0.229 mg/mL(摩爾濃度為0.908 mmol/L)，此時蟲草素到CA的摩爾轉(zhuǎn)化率達91.2%，轉(zhuǎn)化過程基本完成。

2.2 L. casei對蟲草素的生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物鑒定

產(chǎn)物CA為白色粉末，LC-MS結(jié)果：ESI-MS m/z 253[M+H]+, 275[M+Na]+; 核磁數(shù)據(jù)：1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ: 8.42 (1H, s, H-2), 8.08 (1H, s, H-8), 5.87 (1H, d,J=

圖4 轉(zhuǎn)化過程中底物與產(chǎn)物含量分析Fig.4 Measurements of the product CA and the substrate cordycepin during the bio-transformation process

1.56 Hz, H-1′), 4.50 (1H, m, H-2′), 4.37 (1H, m, H-4′), 3.70 (1H, dd,J= 3.18 Hz,J= 12.06 Hz, H-5′a), 3.53 (1H, dd,J= 3.84 Hz,J= 12 Hz, H-5′b), 2.21 (1H, m, H-3′a), 1.89 (1H, m, H-3′b);13C-NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ: 156.5 (C-6), 147.7 (C-4), 146.1 (C-8), 138.3 (C-2), 123.8 (C-5), 91.0(C-1′), 81.3 (C-4′), 75.3 (C-2′), 62.2 (C-5′), 33.8 (C-3′)。所得核磁數(shù)據(jù)與文獻數(shù)據(jù)基本一致[13]，故鑒定化合物CA為3′-脫氧肌苷(3′-deoxyinosine)。

綜合上述測定結(jié)果和蟲草素化學(xué)特征，推測蟲草素本身攜帶的氨基被L.casei水解為羥基，從而形成3′-脫氧肌苷的結(jié)構(gòu)(圖5)。

圖5 蟲草素的生物轉(zhuǎn)化結(jié)果Fig.5 Result of biotransformation of Cordycepin

3 討 論

研究表明，人體腸道菌群的作用與藥物發(fā)揮療效之間有著密不可分的聯(lián)系。藥物進入胃腸道系統(tǒng)后，其有效成分部分以原型物質(zhì)直接被吸收，還有一部分經(jīng)腸道菌群代謝后生成具有藥效功能的新成分，進而達到治療的效果[14]。蟲草素作為一種具有多重功效的核苷類抗菌素，其在人體腸道中的代謝卻鮮有相關(guān)報道。采用體外厭氧培養(yǎng)的方法，研究了腸道中數(shù)量多、被公認為最傳統(tǒng)且最安全的益生菌—乳桿菌對蟲草素的生物轉(zhuǎn)化。結(jié)果表明，L.casei能夠?qū)⑾x草素的氨基水解為羥基，生成新的化學(xué)成分3′-脫氧肌苷。

人體的腸道菌群對藥物的生物轉(zhuǎn)化包括脫甲基[15]、脫羥基[16]、水解反應(yīng)[17]、氧化還原反應(yīng)[18-19]等。蟲草素是一種嘌呤類的生物堿，其本身攜帶的氨基易被酸或酶水解，從而轉(zhuǎn)變成新的化學(xué)結(jié)構(gòu)。藥理學(xué)研究表明，3′-脫氧肌苷是一種抗原蟲藥物。原蟲一般寄生在人或動物的體內(nèi)，有些種類的原蟲會對人造成嚴重危害，例如瘧原蟲、利什曼蟲、克錐氏蟲等[20]。Wataya等[21]在1984年就曾發(fā)現(xiàn)3′-脫氧肌苷能夠抑制利什曼原蟲的生長和繁殖，從而保護宿主。Nakajimashimada等[22]發(fā)現(xiàn)3′-脫氧肌苷在抑制克錐氏原蟲在宿主細胞內(nèi)生長上有著和蟲草素(3′-脫氧腺苷)同樣的作用。由于迄今為止3′-脫氧肌苷還未曾在天然產(chǎn)物中分離出來[13]，故對3′-脫氧肌苷其他方面的藥理活性研究較少，因此蟲草素的生物轉(zhuǎn)化與3′-脫氧肌苷生物活性之間的相關(guān)性，以及在腸道內(nèi)由蟲草素轉(zhuǎn)化所得3′-脫氧肌苷的健康或醫(yī)療功效還需要進行更為深入的研究。

本實驗室在益生菌對蟲草素的生物轉(zhuǎn)化作用的研究中還發(fā)現(xiàn)，并非所有的益生菌均能轉(zhuǎn)化蟲草素。雙歧桿菌與糞腸球菌作為重要的腸道益生菌，并未發(fā)現(xiàn)它們對蟲草素有代謝作用。至于腸道菌群中的其他菌群對蟲草素有無轉(zhuǎn)化作用，尚需進一步探究。