王英男, 彭曉媛, 華曉雨, 楊春雪, 閻秀峰, 藺吉祥

(1.東北林業(yè)大學(xué) 鹽堿地生物資源環(huán)境研究中心/東北鹽堿植被恢復(fù)與重建教育部重點實驗室，哈爾濱 150040；2.東北林業(yè)大學(xué) 園林學(xué)院，哈爾濱 150040)

羊草(Leymuschinensis)，又名堿草，屬禾本科賴草屬根莖型多年生禾草，廣泛分布于俄羅斯的外貝加爾、蒙古國的東北部以及中國東北平原西部和內(nèi)蒙古高原東部等地[1]。羊草是我國東北松嫩草地的建群種，既可分布在地帶性的草甸草原和典型草原中，也可群生于非地帶性的鹽堿地以及低洼地段上[2]。近年來，隨著環(huán)境的不斷惡化以及人類活動的干擾，鹽堿地面積也不斷地擴大，嚴重制約著農(nóng)業(yè)及畜牧業(yè)的發(fā)展。羊草具有生態(tài)適應(yīng)性廣，可塑性強，對干旱和鹽堿化生境具有較高耐受性等優(yōu)良特點[3]。因此，被認為是對鹽堿地生物改良最有前景的牧草之一[4]。

叢枝菌根(Arbuscular mycorrhizal，AM)真菌廣泛分布于各類陸地生態(tài)系統(tǒng)中，能與80%以上高等植物形成共生關(guān)系，促進宿主植物根系對土壤水分和礦質(zhì)營養(yǎng)的吸收和利用，提高植物抗逆性，促進植物生長[5-8]。近年來，利用菌根技術(shù)提高宿主植物對鹽堿脅迫環(huán)境的適應(yīng)能力已經(jīng)成為生物改良鹽堿地研究中的熱點領(lǐng)域。AM與宿主植物形成共生關(guān)系后，能夠通過根外菌絲改變根形態(tài)結(jié)構(gòu)，從而增加共生體根系的長度和養(yǎng)分吸收面積，提高宿主植物的水分含量，改善對礦質(zhì)離子吸收等過程，進而影響宿主植物對鹽堿脅迫的響應(yīng)，從而提高宿主植物抗逆性[9]。

以往的研究多關(guān)注鹽堿脅迫對植物—AM共生體的影響[10-12]，卻忽略了大氣氮沉降與鹽堿脅迫的協(xié)同作用[13]。事實上，由于化石燃料的燃燒、氮肥施用等人為活動的增加，我國大部分地區(qū)存在高氮沉降現(xiàn)象，并已成為世界三大高氮沉降地區(qū)之一[14]。氮沉降增加對AM共生體的生長發(fā)育、根系及根外菌絲對養(yǎng)分的吸收均會產(chǎn)生顯著影響，而關(guān)于氮沉降對植物—AM共生體抗逆性影響的研究還并不多見?；诖?，本文以羊草根部為研究對象，探討不同類型氮素對鹽堿脅迫下羊草—AM共生體根系無機離子和有機酸含量的影響，一方面為利用羊草進行生物改良退化鹽堿草地以及菌肥的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)，另一方面也為探求羊草—AM共生體對氮沉降及鹽堿脅迫的響應(yīng)和反饋提供必要的數(shù)據(jù)支持。

1 材料方法

1.1 材料與設(shè)計

本實驗培養(yǎng)羊草幼苗基質(zhì)為農(nóng)田土、河沙混合(體積比3∶1)，培養(yǎng)基質(zhì)置于高壓蒸汽滅菌鍋中(日本三洋公司，型號：MLS-3780)，在121℃、240 kPa條件下高溫、高壓滅菌2 h，以消除土壤中可能存在的真菌孢子及其它土壤微生物，風(fēng)干備用。盆缽為塑料盆，上口內(nèi)徑15 cm，盆底內(nèi)徑12 cm，高12 cm，用10%的H2O2浸泡15 min，風(fēng)干后每盆裝滅菌混合土2 kg。接種所用的Glomusmosseae(BGC HEB02)由北京農(nóng)林科學(xué)院植物營養(yǎng)與資源研究所提供。接種體由土壤、孢子、菌絲組成。接種處理將20 g接種物放入種子下方2 cm左右深的土層處，不接種處理每盆加入20 g滅菌的菌種。且不接種處理中施加20 ml未滅菌接種物水濾液，以保證不同處理間除AM真菌以外的微生物區(qū)系保持一致。

出苗120 d后，開始進行脅迫處理。本實驗設(shè)置0 mmol/L(CK),100 mmol/L NaCl(S1),200 mmol/L NaCl(S2),100 mmol/L NaHCO3(A1),200 mmol/L NaHCO3(A2)5個處理組[15]。每組處理設(shè)置接種處理(+AM)、未接種處理(-AM)，3個氮水平：0 mmol/L(N0)、10 mmol/L NH4NO3(N1)、10 mmol/L NH4Cl∶NH4NO33∶1(N2)[16]，每個處理共4次重復(fù)，脅迫處理共7天。

1.2 測定指標與方法

1.2.1 樣品制備 將收獲的幼苗用去離子沖洗，收集根樣稱重(鮮重FW)后，置于干燥箱中105℃ 殺青15 min，再于80℃烘干至恒重后稱重(干重DW)，并計算含水量(M)，公式：

稱取根干樣0.05 g置于離心管中，加入10 ml去離子水，于沸水浴提取20 min，冷卻后離心，上清液待測。

1.2.2 有機酸含量測定 試驗用草酸、蘋果酸、酒石酸、甲酸、乳酸、乙酸、檸檬酸及琥珀酸均采用分析純，測定時配置成一定濃度的標準液。

采用離子色譜法測定有機酸，離子色譜儀：美國DIONEX公司,型號：DX-300，附AI-450色譜工作站；色譜柱：ICE-AS6分析柱；電導(dǎo)檢測器：CDM-Ⅱ；干擾抑制器：AMMS-ICEⅡ；移動相：0.4 mmol/L全氟丁酸；流速：1.0 ml/min；柱溫：20℃。用一次性注射器吸取待測樣品5 ml過微孔濾膜(水系，0.22 μm)后進樣測定。試驗用水為超純水。

1.2.3 離子含量測定 羊草根陽離子采用原子吸收分光光度計測定(TAS-990, Purkinje General, 北京)，采用離子色譜法測定陰離子，離子色譜儀：美國DIONEX公司,型號：DX-300，附AI-450色譜工作站；色譜柱：AS4A-SC；電導(dǎo)檢測器：CDM-Ⅱ；流動相：1.8 mmol/L Na2CO3/1.7 mmol/L Na2CO3；流速：2.0 ml/min；柱溫：20℃。用一次性注射器吸取待測樣品5 ml過微孔濾膜(水系，0.22 μm)后進樣測定。試驗用水為超純水。試驗用KNO3,NaCl,Na2SO4,NaH2PO4均采用分析純，測量時配置成一定濃度的標準液。

1.3 數(shù)據(jù)分析

本試驗數(shù)據(jù)處理采用SPSS軟件(Version 13.0, SPSS Inc, Chicago, Illinois)，采用Duncan方法進行多重比較，顯著水平為0.05。采用多因素方差分析檢驗接種AM真菌、鹽堿脅迫與氮素形態(tài)的交互作用對羊草根系離子及有機酸的含量影響。采用Sigmaplot 10.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 氮沉降對鹽堿脅迫下羊草-叢枝菌根共生體根干重及含水量的影響

隨著鹽、堿脅迫濃度的升高，羊草根干重顯著降低，且在堿脅迫下降幅更大，在高濃度鹽堿脅迫下與對照組相比分別下降了15.9%,20.6%(p<0.05，圖1A—1B)。接種AM真菌后，羊草根干重在鹽堿脅迫下均有一定程度提高，但僅在鹽脅迫下達到顯著。氮素添加一定程度上降低了各處理中羊草根干重，且N2處理中羊草根干重較N1處理下降更為明顯。如在100 mmol/L NaCl處理組中，N1處理與未施氮組相比僅下降了10%，而N2處理則使干重下降了35.1%。羊草根含水量的變化趨勢與干重變化趨勢基本相同(圖1C—1D)。

注：圖A，C為鹽脅迫，圖B，D為堿脅迫；不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)；***表示p<0.001,**表示p<0.01,*表示p<0.05,NS表示無顯著差異，下圖同。

圖1氮沉降與鹽堿脅迫下羊草根干重及含水量濃度的變化

2.2 氮沉降對鹽堿脅迫下羊草-叢枝菌根共生體根中陽離子含量的影響

隨著鹽、堿脅迫濃度的升高，羊草根中Na+含量顯著增加，且在堿脅迫條件下增加幅度更大(p<0.05，圖2A—2B)。接種AM真菌顯著降低了在鹽、堿脅迫下羊草根中Na+含量(p<0.05)，在200 mmol/L NaCl處理下，Na+含量降低幅度最大(13.1%)。氮素添加使CK,200 mmol/L NaCl,100 mmol/L NaHCO3處理根中Na+含量顯著提高(p<0.05)，且在高濃度鹽脅迫處理中，N1,N2間差異顯著(p<0.05)，與+AM處理相比分別提高了6%,11.8%。與Na+含量變化趨勢相反，羊草根中K+含量隨著鹽、堿脅迫濃度的提高呈下降趨勢，且在堿脅迫中下降幅度更為明顯(圖2C—2D)。接種AM真菌顯著增加了在鹽、堿脅迫下羊草根中K+含量(p<0.05)，在200 mmol/L NaHCO3處理下，K+含量增加幅度最大(41.9%)。氮素添加對CK處理中K+含量無顯著影響；在堿脅迫處理中，氮素添加顯著降低了根中K+含量(p<0.05)，且在200 mmol/L NaHCO3處理下，下降幅度最大(N1：11.7%，N2：28.2%)，而在鹽脅迫處理中，僅N2處理顯著降低了羊草根中K+含量(p<0.05)。

隨著鹽、堿脅迫濃度的提高，羊草根中Ca2+,Mg2+含量均顯著增加(p<0.05)，且在堿脅迫條件下增加幅度均更為明顯(圖2E—2H)。除200 mmol/L NaCl處理Ca2+,Mg2+及200 mmol/L NaHCO3處理Ca2+含量較-AM處理顯著降低外，其他處理中接種AM真菌對Ca2+,Mg2+含量并未產(chǎn)生顯著影響。氮素添加小幅提高了羊草根中Ca2+,Mg2+含量，但除在高濃度鹽、堿脅迫外，其他處理中均未達到顯著水平。

圖2 氮沉降與鹽堿脅迫下羊草根中Na+，K+，Ca2+，Mg2+及鎂離子濃度的變化

2.3 氮沉降對鹽堿脅迫下羊草-叢枝菌根共生體根中陰離子含量的影響

2.4 氮沉降對鹽堿脅迫下羊草-叢枝菌根共生體根中有機酸含量的影響

本實驗中，我們在羊草根中分別檢測到了檸檬酸、蘋果酸、乙酸、草酸4種有機酸。隨著鹽、堿脅迫濃度的上升羊草根中檸檬酸含量呈顯著上升趨勢(p<0.05)，但在堿脅迫處理下上升趨勢更為明顯。接種AM真菌使羊草根中檸檬酸含量顯著降低(p<0.05)。在鹽脅迫處理組中，氮素添加使檸檬酸含量顯著降低(p<0.05)，但N1,N2處理的降低幅度并無明顯差異。而在堿脅迫處理組中，當脅迫濃度高于100 mmol/L時，氮素添加顯著提高了羊草葉片檸檬酸含量(p<0.05)，其中N1處理提高了23.6%，N2提高了26.2%(圖5A—5B)。隨堿脅迫濃度的提高羊草根中蘋果酸、乙酸含量均呈顯著上升趨勢(p<0.05)。在鹽脅迫下，接種AM真菌及氮素添加均未對根中蘋果酸、乙酸含量產(chǎn)生顯著影響。在堿脅迫處理中，接種AM真菌僅使蘋果酸含量顯著降低(p<0.05)，而對乙酸含量并無顯著影響；與接種AM真菌的影響相反，氮素添加使乙酸含量顯著增加(p<0.05)，而對蘋果酸含量無顯著影響(圖4D—4F)。

3 討 論

圖3 氮沉降與鹽堿脅迫下羊草根中濃度的變化

圖4 氮沉降與鹽堿脅迫下羊草根中檸檬酸、蘋果酸、乙酸及草酸含量的變化

4 結(jié) 論

綜上所述，在鹽堿脅迫下AM真菌能夠改變植物體內(nèi)無機離子與有機酸含量，進而改善宿主植物根部的滲透平衡、減輕離子毒害，大幅提高宿主植物的耐鹽堿能力，從而緩解鹽堿脅迫對植物根部的傷害，有利于植物在鹽堿環(huán)境下的生長。氮沉降的增加對叢枝菌根共生體的耐鹽堿能力產(chǎn)生了一定程度的削弱，且銨態(tài)氮為主導(dǎo)的氮沉降削弱作用更為顯著。