張將，蔣凌霜，孫夢瑩，牟光慶，李新玲，錢方，*，妥彥峰，*

（1.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧大連116034；2.新疆天潤乳業(yè)股份有限公司，新疆烏魯木齊830000）

結(jié)直腸癌（carcinoma of colon and rectum，CRC）屬于惡性腫瘤的一種，是第三大常見癌癥，約占所有新惡性疾病的9.5%，也是全球第四大癌癥死亡原因，且由于老年人口的增加以及炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）等危險因素的流行和飲食習(xí)慣的改變，新病例的數(shù)量正在迅速增加[1-3]。乳酸桿菌屬和雙歧桿菌屬的某些菌株是人體腸道內(nèi)的共生菌株[4-5]，能夠維持宿主腸道的健康[6-7]，在一定程度上還能抑制癌癥的發(fā)生[8-10]。乳酸桿菌屬微生物在自然界中分布廣泛，大醬、饅頭、酸奶、奶酪等食品的發(fā)酵過程均有乳酸桿菌屬微生物的參與，人類食用乳酸桿菌屬微生物的歷史悠久。有體外實驗研究發(fā)現(xiàn)Lactobacillus helveticus var.jugurti[11]、L.casei 01[12]作用于結(jié)腸癌細胞 HT-29可以抑制其增殖。Choi證實嗜酸乳桿菌606可溶性多糖具有抗癌活性，并誘導(dǎo)HT-29細胞凋亡[13]。也有動物實驗研究發(fā)現(xiàn)從開菲爾菌株中得到的胞外多糖（exopolysaccharide，EPS）經(jīng)小鼠口服后對腫瘤生長具有抑制作用[14]，Bifidobacterium bifidum的EPS對大鼠荷肝腫瘤亦有明顯抑瘤效果[15]。而且研究表明EPS在對癌癥的輔助治療上，具有安全性高、毒副作用小以及抑瘤效果好等優(yōu)點[16-17]。Kim等的研究結(jié)果表明cb-EPS可能通過直接影響細胞形態(tài)而不是細胞周期來抑制結(jié)腸癌細胞增殖[18]。

本研究擬對大連工業(yè)大學(xué)大連市益生菌功能研究重點實驗室保藏的植物乳桿菌所產(chǎn)胞外多糖進行研究，比較不同乳桿菌菌株所產(chǎn)胞外多糖對結(jié)腸癌細胞HT-29增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

發(fā)酵菌株為大連工業(yè)大學(xué)大連市益生菌功能研究重點實驗室保存菌株，如表1所示；人結(jié)腸癌上皮細胞HT-29：中國科學(xué)院上海細胞庫；多聚甲醛、甲醇、無水乙醇、苯酚：天津市大茂化學(xué)試劑廠；活性氧（reactive oxygen species，ROS） 測試盒、caspase 8 試劑盒、細胞凋亡試劑盒：南京建成生物工程研究所有限公司；多糖標準品試劑盒：GE Healthcare公司；TritonX-100、三氯乙酸：天津市光復(fù)精細化工研究所；30%過氧化氫、濃硫酸：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；BCA蛋白濃度檢測試劑盒、PBS磷酸鹽緩沖溶液、胰酶消化液：北京Solarbio公司；改良型RPMI-1640培養(yǎng)基：美國Gibco公司。

表1 試驗使用菌株Table 1 The strains of the experiment

1.2 主要儀器設(shè)備

KG-SX-500滅菌鍋：上海精密實驗設(shè)備有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺：蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；MCO-18AIC（UV）CO2培養(yǎng)箱：日本 SANYO公司；FQC生化培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；S210-k精密pH計：梅特勒-托利多儀器有限公司；5804R冷凍離心機：德國Eppendorf公司；1510酶標儀：美國Thermo Fisher Scientific公司；5804R型冷凍離心機：Eppendorf中國有限公司；SC-3610型低速離心機：科大創(chuàng)新股份有限公司；CKX41倒置電子顯微鏡：OLYMPUS公司；L320生物光學(xué)顯微鏡：深圳市西派克光學(xué)儀器有限公司；Alpha 1-2真空凍干機：德國Marin Christ公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌胞外多糖粗糖的提取

1.3.1.1 菌株富集培養(yǎng)

試驗所用菌株均為-80℃保存（大連工業(yè)大學(xué)大連市益生菌功能特性研究重點實驗室提供）。凍存菌株37℃解凍，振蕩均勻后，取0.1 mL接種于5 mL的MRS液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)18 h，連續(xù)傳代2次后，于4℃保存待用。

1.3.1.2 乳酸菌胞外粗多糖的提取

乳酸菌胞外多糖的提取采用Li Zhang的方法[19]，用冷凍離心機將擴大培養(yǎng)后的含乳酸菌胞外多糖的培養(yǎng)液在4℃、9 000×g條件下離心5 min，去除菌體沉淀保留上清液。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將得到的上清液進行蒸發(fā)濃縮至原體積的1/5，加入100%濃度的液態(tài)三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）至終濃度為 4 g/100 mL，在室溫條件下磁力攪拌30 min。攪拌結(jié)束后將糖液用冷凍離心機在4℃、10 000×g條件下離心15 min，收集上清液，然后加入2倍～3倍體積的無水乙醇，4℃條件下靜置24 h，使胞外多糖能夠完全沉淀。醇沉結(jié)束后用冷凍離心機在4℃、1 000×g條件下離心20 min，棄去上清液，收集多糖沉淀，將得到的沉淀溶于適量的超純水后，分裝到透析袋中（8 kDa～14 kDa），在4℃層析柜中用超純水透析3 d，每隔4 h換一次水以便去除小分子。透析結(jié)束后將糖液倒入平板中用凍干機冷凍干燥15 h得到胞外多糖粗糖樣品，用保鮮膜封口保存在干燥器中。

1.3.2 乳酸菌胞外多糖粗糖的糖濃度及蛋白質(zhì)含量的測定

乳酸菌胞外多糖的測定參照王文平[20]所描述的試驗方法，采用苯酚-硫酸法測定樣品糖濃度，將凍干后的乳酸菌樣品溶于PBS溶液中（pH 7.2），吸取1 mL，加入1 mL 5%苯酚，5 mL濃硫酸后，振蕩搖勻，靜置5 min，沸水浴15 min，室溫放置 20 min后，在波長490 nm處的吸光度值。以葡萄糖為標準品，以濃度為橫坐標、OD490為縱坐標繪制標準曲線。

乳酸菌胞外多糖中蛋白質(zhì)含量的測定使用考馬斯亮藍G-250方法來測定粗糖蛋白含量[21]。將凍干后的乳酸菌粗多糖樣品溶于PBS溶液中（pH 7.4），吸取100 μL適當(dāng)稀釋的樣品加入5 mL考馬斯亮藍G-250溶液，室溫靜置反應(yīng)10 min，然后用酶標儀在595 nm波長下測吸光值（OD）。以牛血清白蛋白為標準品，以濃度為橫坐標、OD595為縱坐標繪制標準曲線。

1.3.3 不同乳酸菌胞外多糖粗糖對HT-29增殖的影響

不同的乳酸菌胞外多糖對HT-29結(jié)腸癌細胞的影響采用Sun J等[22]的方法，將HT-29結(jié)腸癌細胞接種到96孔板中，接種細胞濃度為5×104個細胞/mL，接種量為每孔 200 μL，培養(yǎng) 24 h（5%CO2，37 ℃）后，用pH7.4的PBS迅速清洗2次，將不同乳酸菌（LGG、3、4、9、12、13、14、24、27、31、32、37、44、49、50） 的胞外多糖粗糖溶解在無胎牛血清RPMI1640細胞培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基中加入不同的胞外多糖粗糖，使其終濃度分別為250 μg/mL，以無胎牛血清為RPMI1640空白對照組。培養(yǎng)48 h后，吸出孔內(nèi)所有液體，用pH7.4的PBS迅速清洗2次，每孔加入100 μL細胞培養(yǎng)液和20 μL 3-（4，5-二甲基吡啶-2-基）-5-（3-羧基甲氧基苯基）-2-（4-磺苯基）-2H-四唑 [3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-5-（3-carboxymethoxyphenyl）-2-（4-sulfophenyl）-2H-tetrazolium，MTS]試劑（提前解凍），繼續(xù)在 37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，用酶標儀測量在490 nm處的吸光度并計算抑制率。

1.3.4 胞外多糖粗糖的分離純化

采用Chu-Ting L等的方法粗多糖首先用DEAESepharose Fast Flow離子柱進行分離和純化。稱取0.1 g凍干的多糖溶于10 mL超純水中，用0.22 μm濾膜過濾后用Tris-HCl緩沖液溶解上樣。第一步洗脫用Tris-HCl緩沖液（約2 h），第二步梯度洗脫同時使用Tris-HCl與1.0 mol/L NaCl（約2 h）。每管收集量為5 mL；流速為2 mL/min。經(jīng)過DEAE-Sepharose Fast Flow離子柱分離純化后的多糖采用Sepharose CL-6B凝膠柱純化，上樣濃度為10 mg/mL，上樣量2 mL，用0.22 μm濾膜過濾后用含0.15 mol/L NaCl的Tris-HCl緩沖液溶解。每管收集5 mL；流速為0.4 mL/min。將分離得到的樣品經(jīng)8 kDa～14 kDa透析袋透析、冷凍干燥得到多糖樣品。采用苯酚硫酸法測定分離純化后的多糖組分中多糖含量。采用MTS方法測定分離純化后的多糖組分對HT-29細胞增殖的影響。

1.3.5 活性氧（reactive oxygen species，ROS）的測定

活性氧的測定采用Ashwaq A S等[23]的方法，將HT-29結(jié)腸癌細胞接種到黑色96孔板中，接種細胞濃度為 5×104個細胞/mL，接種量為每孔 200 μL，培養(yǎng)24 h（5%CO2，37 ℃）后，用 pH7.4的 PBS 迅速清洗 2次，加入無胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，設(shè)置1個空白對照組、1個陽性對照組和8個陰性對照組，將篩選出來的乳酸菌胞外多糖按照最終濃度為50、100、250、500 μg/mL溶解在RPMI1640培養(yǎng)基中后加入細胞，培養(yǎng)44 h后陽性對照組加入對照物Rosup（Rosup為活性氧陽性誘導(dǎo)藥物，根據(jù)其熒光信號強度可以分析活性氧的真實水平）100 μL。細胞在培養(yǎng)48 h時，吸出所有多糖液及培養(yǎng)液，每孔加入100 μL 稀釋好的 2′，7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽（2，7-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）（按照 1∶1 000 用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10 μmol/L）。在37℃避光孵育30 min后，用熒光酶標儀（激發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長525 nm）測其吸光度。根據(jù)所測吸光度值可以知道細胞內(nèi)的ROS水平。

1.3.6 Tunel法檢測HT-29細胞凋亡

本試驗選用Tunel凋亡原位檢測試劑盒（南京建成生物研究所）檢測L.plantarum 12 EPS對HT-29細胞凋亡的影響。將HT-29結(jié)腸癌細胞接種到孔板中的爬片上，接種細胞濃度為1×104個細胞/孔，接種量為每孔 2 mL，培養(yǎng) 24 h（5%CO2，37 ℃）后，將加入乳酸菌胞外多糖用RPMI1640培養(yǎng)液稀釋到50、100、250、500 μg/mL加入6孔板中培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)結(jié)束后從孔板中取出細胞爬片，在超凈工作臺中吹風(fēng)晾干，再于固定液中室溫固定1 h、封閉液中封閉10 min、浸入通透液滲透2 min、標記和顯色，最后光學(xué)顯微鏡下分別觀察5個視野，每個視野計數(shù)100個細胞，確定其中發(fā)生凋亡的細胞個數(shù)，進行數(shù)據(jù)分析。

凋亡率/%=[紫色細胞總數(shù)/（紫色和綠色細胞總數(shù)）]×100

1.3.7 caspase 8活性檢測

本試驗選用caspase 8活性檢測試劑盒（南京建成生物研究所）測定細胞凋亡，按試劑盒說明書進行操作。接種細胞濃度為2×105個細胞/孔，接種量為每孔2 mL，培養(yǎng) 24 h（5%CO2，37 ℃）后，將加入 12 號乳酸菌胞外多糖用RPMI1640培養(yǎng)液稀釋到50、100、250、500 μg/mL加入6孔板中培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)結(jié)束后，用胰蛋白酶消化細胞并收集，用pH7.4的PBS迅速清洗保留沉淀，然后按說明書要求加入適量裂解液，震蕩混勻后冰浴裂解30 min，其間渦流震蕩3次（10 s/次），然后離心（4℃，10 000×g，20 min），取上清液于冰上備用，之后用BCA蛋白濃度檢測試劑盒測定蛋白濃度，并立即測定caspase 8的酶活。

按表2所示順序添加試劑搖勻，避免產(chǎn)生氣泡，然后于37℃孵育過夜，用酶標儀于405 nm處測吸光度，最后通過計算OD誘導(dǎo)劑/OD陰性對照的倍數(shù)來確定誘導(dǎo)凋亡組caspase 8的活化程度。

表2 Caspase 8反應(yīng)體系表Table 2 The table of caspase 8 reaction system

1.4 統(tǒng)計分析

試驗中所有試驗至少重復(fù)3次，方差分析及差異顯著性分析（p＜0.05）采用SPSS20.0統(tǒng)計分析軟件進行分析，圖表采用OriginPro 8.5進行繪制。

2 結(jié)果與討論

2.1 乳桿菌所產(chǎn)胞外多糖成分分析

根據(jù)苯酚-硫酸法測得梯度葡萄糖溶液的標準曲線回歸方程為 y=3.791 1x+0.070 7（R2=0.992 4），根據(jù)此方程計算得到15株植物乳桿菌胞外多糖粗糖的總糖含量。

按照考馬斯亮藍G-250方法測得標準蛋白溶液的蛋白含量標曲的回歸方程為y=0.068 8x-0.021 7（R2=0.994 1），根據(jù)此方程計算得到15株植物乳桿菌胞外多糖中蛋白質(zhì)的含量。不同菌株EPS的多糖及蛋白濃度以及對HT-29抑制率如表3。

表3 不同菌株EPS的多糖及蛋白濃度以及對HT-29抑制率Table 3 The polysaccharide，protein concentrations and antiprolierave on HT-29 cells of EPS from different strains

L.plantarum 3號、L.plantarum 12號 L.plantarum 13 號 、L.plantarum 14 號、L.plantarum 24 號、L.plantarum32號、L.plantarum 37號L.plantarum 44號、L.plantarum49號、L.plantarum 50號乳酸菌的胞外多糖產(chǎn)量均較高。采用MTS法研究15種乳酸菌EPS在濃度為250 μg/mL時，對HT-29細胞增殖的影響，表3試驗結(jié)果表明，L.plantarum 12號、L.plantarum 14號、L.plantarum 27號、L.plantarum 31號、L.plantarum 32號、L.plantarum 37號乳酸菌胞外多糖均對HT-29細胞有抑制作用。結(jié)合胞外多糖含量以及對HT-29細胞增殖抑結(jié)果，選擇L.plantarum 12，L.plantarum 14，L.plantarum 32和L.plantarum 37進行后續(xù)試驗。

2.2 4株菌胞外多糖對HT-29細胞增殖的影響

L.plantarum 12，L.plantarum 14，L.plantarum 32 和L.plantarum 37 4 株菌胞外多糖按照 50、100、250、500 μg/mL作用 HT-29細胞結(jié)果如圖 1所示，L.plantarum12 EPS 在 50、100、250 μg/mL 對 HT-29 細胞增殖的抑制效果高于L.plantarum 14、L.plantarum 32和L.plantarum 37三株菌EPS抑制效果，且在250 μg/mL時達到了最高抑制率27.58%。所以選用L.plantarum 12為后續(xù)試驗用菌，并且在后續(xù)試驗中將對L.plantarum 12的EPS對HT-29細胞增殖抑制的機理做更深入的研究。

圖1 4種乳酸菌EPS對HT-29細胞增殖的影響Fig.1 The effects of 4 kind of EPS on the proliferation of HT-29 cells

2.3 L.plantarum 12粗多糖的分離純化

2.3.1 L.plantarum 12粗多糖DEAE-Sepharose Fast Flow離子柱純化

胞外多糖在提取階段經(jīng)過三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）去除蛋白、無水乙醇沉淀多糖以及透析可以除去大部分的雜質(zhì)，然而多糖本身是由多種組分組成，而且含有少量的糖以外的物質(zhì)，所以需要進一步對其進行分離純化，來獲得單一的組分。離子交換層析的原理是，被分離組分帶有不同的電荷，以不同的結(jié)合力與離子交換劑結(jié)合，當(dāng)洗脫液離子強度不同時才能將其洗脫出來。DEAE-Sepharose Fast Flow是一種陰離子交換劑，凝膠的顆粒比較大，可以進行較大流速洗脫，常用于粗多糖的分離純化。L.plantarum 12DEAESepharose Fast Flow離子交換柱層析結(jié)果見圖2。

圖2 L.plantarum 12 DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換柱層析Fig.2 DEAE-Sepharose Fast Flow·ion exchange column chromatograpHy of L.plantarum 12

經(jīng)過DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換柱分離，12號粗多糖洗脫出來兩個組分，即EPS12-1、EPS12-2（如圖2），透析、凍干后稱重，分別為分離前粗多糖質(zhì)量的37.7%和11.4%。由此可見，直接由Tris-HCl洗脫液洗脫出來的組分EPS12-1是中性多糖，而EPS12-2是由含NaCl的洗脫液梯度洗脫出來的，說明該組分是帶負電荷的酸性多糖，或者是帶有酸性基團的糖復(fù)合物。

2.3.2 L.plantarum 12粗多糖的Sepharose CL-6B凝膠柱分離純化

離子交換柱只能分離出帶電荷相同的組分，然而帶電量相同而分子量不同的組分不能得到完全的分離，需要經(jīng)過體積排阻色譜層析對其進行純化。分子大小不同，洗脫體積也不同，從而能夠分離出不同分子量的單一組分。需要通過凝膠柱進一步純化。組分EPS12-1和EPS12-2分別經(jīng)過Sepharose CL-6B凝膠柱后的洗脫曲線如圖3、圖4所示。

從圖3、圖4中可以看出，純化后兩種組分的洗脫曲線都是比較對稱的單一峰，表明這兩種EPS12組分為分子量大小均一的單一組分。收集出峰管中的液體，經(jīng)過48 h透析后，即為純化后的EPS12-1和EPS12-2。

2.3.3 分離純化后單一組分對HT-29細胞增殖的影響

分離純化后的兩種多糖含量分別為31.82%和35.21%。在將分離純化后的兩種多糖分別以不同濃度作用于HT-29細胞后，通過MTS法測定細胞增殖情況，結(jié)果如圖5所示。

圖3 EPS12-1 Sepharose CL-6B凝膠柱層析Fig.3 Sepharose CL-6B gel column chromatography of EPS 12-1

圖4 EPS12-2 Sepharose CL-6B凝膠柱層析Fig.4 Sepharose CL-6B gel column chromatography of EPS12-2

圖5 不同濃度的EPS 12-1和EPS 12-2對HT-29細胞增殖的影響Fig.5 Effects of different concentrations of EPS 12-1 and EPS 12-2 on the proliferation of HT-29 cells

由圖5可知，分離純化后的EPS12-1和EPS12-2對細胞增殖同樣在250 μg/mL時達到最高分別為7.11%和12.0%（p＜0.05），而且兩種EPS的作用濃度為 50 μg/mL～250 μg/mL 時，抑制 HT-29 細胞增殖效果隨著濃度的增加而顯著增加（p＜0.05），在EPS濃度為500 μg/mL時有所下降但是不顯著，且單一組分對HT-29細胞抑制效果低于粗多糖，因此采用粗多糖進行后續(xù)研究。

Asker等[24]研究表明從瑞土乳桿菌分離出來的EPS分子量越小抗氧化能力越強，是因為低分子量的多糖比較容易結(jié)合自由基的緣故。劉宇等[25]報道從酸奶發(fā)酵劑L.delbrueckii ssp.bulgaricus OLL 1073R-1分離得到的含β-1，6糖苷鍵較少的酸性多糖能夠有效的促進小鼠淋巴細胞的增殖，具有調(diào)節(jié)宿主抗腫瘤活性的作用。Bleau等[26]對L.rhamnosus ATCC 9595所產(chǎn)的EPS結(jié)構(gòu)與免疫功能之間的關(guān)系進行研究，最終發(fā)現(xiàn)高分子量、具有一定空間構(gòu)型的EPS具有顯著免疫調(diào)節(jié)功能，通過水解破壞其結(jié)構(gòu)會導(dǎo)致IL-6的減少以及淋巴細胞活動減弱。

2.4 L.plantarum 12胞外多糖對HT-29細胞內(nèi)ROS水平的影響

細胞受到外界刺激時，會產(chǎn)生大量高活性分子如活性氧自由基（ROS），導(dǎo)致細胞自身抗氧化能力不夠或氧化系統(tǒng)失衡，從而引起細胞的損傷甚至凋亡。因此通過測定細胞內(nèi)活性氧水平可以大致判斷細胞的狀態(tài)。L.plantarum 12胞外多糖對HT-29細胞內(nèi)ROS水平的影響如圖6所示。

圖6 不同濃度EPS12誘導(dǎo)HT-29細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生Fig.6 The different concentrations of EPS12 in HT29-treated cells induced ROS generation

由圖6可知，L.plantarum 12多糖的4個濃度處理的HT-29細胞內(nèi)的活性氧強度依次為對照組的108.99%、109.56%、118.33%、113.83%?；钚匝鯊姸仍礁?，說明細胞正處于某個凋亡狀態(tài)，因此可以判斷乳酸菌的胞外多糖抑制結(jié)腸癌細胞HT-29增殖的機理是誘導(dǎo)細胞凋亡。同時，試驗結(jié)果表明，250 μg/mL是多糖誘導(dǎo)凋亡的最佳濃度，這與之前測得的多糖對HT-29細胞的抑制率趨勢一致。ROS是正常細胞代謝的組成部分，并且是增殖，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和凋亡等細胞內(nèi)過程所必需的。當(dāng)細胞內(nèi)ROS水平升高后，細胞內(nèi)原本平衡的氧化還原狀態(tài)被破壞，當(dāng)ROS量達到一定值，超過其自身的清除能力后，就會導(dǎo)致細胞凋亡。張艷生等[27]研究發(fā)現(xiàn)5，7-二甲氧基黃酮可以通過促進HT-29細胞產(chǎn)生ROS，而使得細胞發(fā)生凋亡。Hu P等[28]揭示活性副干酪乳桿菌M5L通過ROS產(chǎn)生誘導(dǎo)HT-29細胞凋亡。

2.5 L.plantarum12胞外多糖對HT-29細胞凋亡的影響

細胞發(fā)生凋亡會在胞質(zhì)內(nèi)形成許多有完整膜結(jié)構(gòu)的“凋亡小體”，激活細胞內(nèi)的核酸內(nèi)切酶，該酶可把DNA切割成180 bp～200 bp的片斷，通過標記在缺口處的熒光素以及甲基綠的染色反應(yīng)可以在光學(xué)顯微鏡下觀察到細胞凋亡：凋亡細胞呈紫色，正常細胞因無斷裂DNA而呈綠色。

不同濃度12號多糖處理后的HT-29細胞用Tunel法染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察的結(jié)果如圖7所示。

Tunel法測定L.plantarum 12胞外多糖作用HT-29細胞后其細胞凋亡率如圖8所示。

圖7 Tunel法測定不同濃度12號多糖處理的HT-29細胞Fig.7 Effects of different concentrations of EPS12 on HT-29 cells with Tunel method

圖8 不同濃度EPS12誘導(dǎo)HT-29細胞的凋亡率Fig.8 Induction of apoptosis of HT-29 cells by EPS12 at different concentrations

由圖7可知，在光學(xué)顯微鏡下肉眼觀察到，隨著多糖濃度（50 μg/mL～250 μg/mL）升高，視野內(nèi)的紫色細胞數(shù)目所占的比例增加。由圖7、圖8可知，在250μg/mL濃度時達到最大值，而到500 μg/mL時又有所下降。紫色細胞數(shù)目越多，代表斷裂的DNA越多，及凋亡細胞越多。此試驗進一步表明L.plantarum 12多糖抑制HT-29結(jié)腸癌細胞增殖的原理是誘導(dǎo)細胞凋亡。

2.6 L.plantarum 12胞外多糖對HT-29細胞內(nèi)caspase 8酶活的影響

不同濃度EPS對HT-29細胞內(nèi)caspase 8活性的影響見表4。

L.plantarum 12 EPS作用后HT-29細胞內(nèi)caspase 8 的活化倍數(shù)（如表 4）分別為 1.02、1.08、1.10、1.04，當(dāng)EPS 作用濃度在 50 μg/mL～250 μg/mL 時，caspase 8 的活化程度提度以及活化倍數(shù)提高隨著EPS濃度的升高而增加，在L.plantarum 12 EPS濃度為250 μg/mL時，caspase 8的活化程度顯著高于其它三個濃度的活化程度（p＜0.005），證明此濃度下細胞凋亡最強烈。

表4 不同濃度EPS對HT-29細胞內(nèi)caspase 8活性的影響Table 4 Effects of different concentrations of EPS 12 on caspase 8 activity in HT-29 cells

caspase 8是caspase家族中最重要的起始因子，它可以激活所有的caspase級聯(lián)反應(yīng)，從而激活下游細胞凋亡，誘導(dǎo)細胞凋亡[29]。Zhuang H[30]研究表明當(dāng)歸多糖引起的細胞死亡與半胱天冬酶活性有關(guān)，伴隨著線粒體膜電位的喪失，細胞色素C的釋放以及從細胞質(zhì)到線粒體的Bax易位。Zhou等[31]研究發(fā)現(xiàn)z-IETDFMK可以通過阻斷了CT 26細胞中caspase 8和caspase 3的活化，來抑制EPS 116誘導(dǎo)的細胞凋亡。Zhang等[32]研究發(fā)現(xiàn)IFN-γ能逆轉(zhuǎn)SY5Y細胞對TRAIL誘導(dǎo)凋亡功能的抵抗，其機制可能是IFN-γ能上調(diào)SY5Y細胞caspase 8的表達。

3 結(jié)論

本文通過對結(jié)腸癌細胞HT-29抑制率的測定，結(jié)合多糖產(chǎn)量和多糖濃度從實驗室保藏的15菌種中篩選出一株高產(chǎn)且抑制率最高的乳酸菌，即12號乳酸菌。MTS法研究發(fā)現(xiàn)L.plantarum 12的EPS對HT-29細胞增殖的抑制率最高，L.plantarum 12胞外多糖在250 μg/mL時抑制率最高為27.58%。分離純化后的EPS12-1和EPS12-2在250 μg/mL存在最高抑制率為7.11%和12.0%。L.plantarum 12的EPS可能通過增加ROS酶活和激活caspase8來抑制HT-29增殖。