劉美辰

（北京市糧油食品檢驗所，北京100162）

隨著工業(yè)、城市污染的加劇，土壤重金屬污染日益嚴重，被重金屬鎘污染的糧食會危害人體健康，影響機體代謝，使其發(fā)生紊亂，誘發(fā)疾病，甚至死亡[1-2]。

世界各國對鎘的最大允許含量均有限定要求，并作為強制性檢測項目進行檢測[3]，我國《糧食管理流通條例》（國務院令第407號）和GB 2715-2016《食品安全國家標準糧食》也都明確規(guī)定糧食收購要對鎘進行檢測。由于我國糧油種植區(qū)分布廣泛，糧食收購多集中在縣以下單位的收儲庫點，時間短，收購量大，能否快速、準確地檢測鎘成為影響糧食收購效率的重要因素[4]。目前檢測糧食中鎘常用的方法有石墨爐原子吸收光譜法[5]、原子熒光光譜法[6]、電感耦合等離子體質譜法[7]等，這些方法均對試驗條件和檢測技術有較高要求，檢測時間長，檢測步驟繁瑣，成本太高，都不能滿足現(xiàn)場快速檢測的需要。因此，建立簡便、高效、低成本的快速檢測方法迫在眉睫。

近年來快速發(fā)展的免疫膠體金技術是以膠體金作為示蹤標志物應用于抗原-抗體的一種新型的免疫標記技術，已在病原[8-9]、真菌毒素[10-11]、殺菌劑[12]、抗生素[13]和興奮劑[14]等檢測項目上廣泛應用并已標準化。目前可用于糧食中鎘檢測的膠體金快速定量法已見報道[15-16]，為驗證該方法適用于國家標準的可行性，對其檢出限、定量限、準確性、重復性、穩(wěn)定性、臺間差和檢測時長等參數進行了測試，為該方法的標準化工作提供了試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

重金屬鎘快速定量檢測試紙條：北京華安麥科生物技術有限公司，產品批次20180524，規(guī)格16 T/盒。盒內配有試驗所需的樣品提取液、萃取劑、反萃取劑、稀釋液和螯合劑，未標注明確成分。

1.2 儀器與設備

干式加熱器（HMG-GS）、計時器：北京華安麥科生物技術有限公司；膠體金讀數儀3臺（BMZ 6000）：北京美正生物科技有限公司；移液器（200 μL）：賽多利斯（上海）貿易有限公司；離心管（20 mL和50 mL）：潔特；一次性手套：麥迪康；離心機（DM0412）：大龍興創(chuàng)實驗儀器（北京）有限公司；原子吸收光譜儀（PinAAcle 900T）：Perkinelmer公司；渦旋混合器（TZL-5013）：蘇州珀西瓦爾實驗設備有限公司；分析天平（PL-602E）：梅特勒-托利多。

1.3 檢測原理

膠體金快速定量法應用了競爭抑制膠體金免疫層析的原理，將金標抗體結合在金標墊/微孔中，將抗原（T線）和二抗（C線）固定于硝酸纖維素膜（NC膜）上，當待測樣品加到樣品墊/微孔中后，樣本中抗原與金標抗體結合，通過層析作用向前移動。當移至（T線）區(qū)域時，偶聯(lián)抗原和未結合金標抗體結合而被截留，聚集在檢測線（T線）上，剩余金標抗體越過檢測線（T線），在質控線（C線）處與二抗結合顯色，配合膠體金讀數儀可直接讀取檢測結果。

1.4 操作方法

膠體金快速定量法：按照重金屬鎘快速定量檢測試紙條盒內附帶的操作說明進行，具體為稱取2.0 g±0.02 g均質（過20目篩網）樣本于50 mL離心管中，加入6 mL樣品提取液和4 mL萃取劑，具塞，充分振蕩5min后，4000r/min離心5min；取1mL上清，加入2mL反萃取劑，振蕩3 min，4 000 r/min離心3 min；棄上清，取500 μL下清，立即加入2 mL稀釋液（5 min內），振蕩混勻；取 250 μL 該混合液，加入 200 μL 螯合劑，振蕩均勻，1 min內待檢。

石墨爐原子吸收光譜法：按照國標GB 5009.15-2014《食品安全國家標準食品中鎘的測定》執(zhí)行。

1.5 樣品

據國家統(tǒng)計局公告，2012年我國糧食總產量為58 957萬噸，而稻谷、小麥和玉米三大作物的總產量占糧食總產量的90.4%（其中稻谷20 429萬噸，小麥12 058萬噸，玉米20 812萬噸），故選擇大米/糙米、小麥和玉米為研究對象。測試采用陽性樣品、陰性樣品和陽-陰定量混配樣品進行，所有樣品均使用國家標準方法（石墨爐原子吸收光譜法）定值。

國家標準GB 2762-2017《食品安全國家標準食品中污染物限量》中規(guī)定大米/糙米中鎘的限量值為200 μg/kg、小麥和玉米中鎘的限量值為 100 μg/kg。根據國標限量值和實際樣品的污染情況，選取50 μg/kg～100 μg/kg、100 μg/kg～200 μg/kg 和 300 μg/kg～350 μg/kg 3個濃度水平的大米/糙米樣品；選取50μg/kg～100μg/kg、100 μg/kg～150 μg/kg 和 150 μg/kg～250 μg/kg 3 個濃度水平的小麥和玉米樣品進行測試。大米/糙米、小麥和玉米的陰性樣品各20份，大米/糙米的天然陽性樣品3份，小麥的天然陽性樣品1份，小麥的陽-陰定量混配樣品2份，玉米的天然陽性樣品1份，玉米的陽-陰定量混配樣品2份，共計69份樣品進行測試。

每份測試樣品均從大樣經粗碎與連續(xù)多次用四分法縮減至0.5 kg～1 kg，粉碎至80%以上過20目篩，篩上物和篩下物混勻。

2 結果與分析

2.1 方法檢出限及定量限

依據LS/T 6402-2017《糧油檢驗設備和方法標準適用性驗證及結果評價一般原則》中6.1的規(guī)定，使用膠體金快速定量法連續(xù)獨立測定20個陰性樣品，根據檢出限=陰性樣品測定平均值+3倍標準偏差、定量限=陰性樣品測定平均值+10倍標準偏差，計算得出該方法的檢出限和定量限，具體見表1。

表1 方法檢出限和定量限Table 1 The test result of limit of detection and limit of quantitation μg/kg

如表1所示，該方法測定大米/糙米的檢出限為17.23 μg/kg，定量限為 48.84 μg/kg；測定小麥的檢出限為 13.42 μg/kg，定量限為 39.35 μg/kg；測定玉米的檢出限為 14.86 μg/kg，定量限為 44.59 μg/kg，與國標限量值相比可知該方法能夠滿足國標檢測要求。

2.2 準確性

依據LS/T 6402-2017《糧油檢驗設備和方法標準適用性驗證及結果評價一般原則》中6.2的規(guī)定，使用膠體金快速定量法與石墨爐原子吸收光譜法分別對大米/糙米、小麥和玉米樣品進行雙試驗檢測，取平均值作為檢測結果，并采用配對t檢驗法比較兩種方法的檢測結果是否存在顯著性差異。使用EXCEL函數計算兩種方法檢測結果的差值Di、D均值、SD和tD，具體數據見表2。

表2 準確度測試結果Table 2 The test result of accruacy

查 t分布表可知，t0.05，8=2.306，而計算值 tD=1.16＜t0.05，8，tD未超過查表值說明兩種方法的測定結果之間無顯著差異。

2.3 重復性

依據LS/T 6402-2017《糧油檢驗設備和方法標準適用性驗證及結果評價一般原則》中6.3的規(guī)定，采用一臺驗證用設備6次重復測定中等濃度水平的大米、小麥和玉米樣品，采用χ2檢驗法判斷該方法重復性測定標準差是否超過標準方法中規(guī)定的重復性要求，同時采用6次測定極差與現(xiàn)有國家標準規(guī)定的6次測定重復性臨界極差進行對照，考察該方法的重復性，具體數據見表3。

表3 重復性測試結果Table 3 The test result of repeatability

2.3.1 大米樣品

測定次數n=6，平均值194.07 μg/kg，標準偏差S=11.13 μg/kg，極差=29.26 μg/kg；GB 5009.15-2014《食品安全國家標準食品中鎘的測定》規(guī)定重復性條件下，兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的20%，則大米樣品兩次測定絕對差（即重復性限r）≤38.81，國標規(guī)定的重復性標準差Sr=r/2.8=13.86，6次測定的重復性臨界極差CrR95（6）=f（6）×Sr=55.44，重復性標準差χ2=（n-1）S2/Sr2=3.22。顯著性水平α=0.05情況下，查表得 χ20.95(5)=11.07，χ2=3.22＜χ20.95(5)，且極差29.26＜重復性臨界極差CrR95（6），說明該方法測定大米/糙米樣品中重金屬鎘的重復性標準差和極差均不超過國家標準方法中規(guī)定的重復性要求。

2.3.2 小麥樣品

測定次數n=6，平均值117.18 μg/kg，標準偏差S=1.62 μg/kg，極差=3.86 μg/kg；GB 5009.15-2014《食品安全國家標準食品中鎘的測定》規(guī)定重復性條件下，兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的20%，則小麥樣品兩次測定絕對差（即重復性限r）≤23.44，國標規(guī)定的重復性標準差Sr=r/2.8=8.37，6次測定的重復性臨界極差CrR95（6）=f（6）×0.95(5)=33.48，重復性標準差χ2=（n-1）S2/Sr2=0.19。顯著性水平 α=0.05情況下，查表得 χ20.95(5)=11.07，χ2=0.19＜χ20.95(5)，且極差 3.86＜重復性臨界極差CrR95（6），說明該方法測定小麥樣品中重金屬鎘的重復性標準差和極差均不超過國家標準方法中規(guī)定的重復性要求。

2.3.3 玉米樣品

測定次數n=6，平均值131.38 μg/kg，標準偏差S=3.29 μg/kg，極差=7.76 μg/kg；GB 5009.15-2014《食品安全國家標準食品中鎘的測定》規(guī)定重復性條件下，兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的20%，則玉米樣品兩次測定絕對差（即重復性限r）≤26.28，國標規(guī)定的重復性標準差Sr=r/2.8=9.39，6次測定的重復性臨界極差CrR0.95(6)=f（6）×Sr=37.56，重復性標準差χ2=（n-1）S2/Sr2=0.61。顯著性水平α=0.05情況下，查表得 χ20.95(5)=11.07，χ2=0.61＜χ20.95(5)，且極差 7.76＜重復性臨界極差CrR95（6），說明該方法測定玉米樣品中重金屬鎘的重復性標準差和極差均不超過國家標準方法中規(guī)定的重復性要求。

2.4 穩(wěn)定性

依據LS/T 6402-2017《糧油檢驗設備和方法標準適用性驗證及結果評價一般原則》中6.4的規(guī)定，采用一臺驗證用設備持續(xù)開機24 h，對中等濃度水平的大米樣品（190.2 μg/kg）連續(xù)測定13次，以測定數據的標準差和極差是否超過標準方法中規(guī)定的重復性要求來考察設備的穩(wěn)定性，具體數據見表4。

表4 穩(wěn)定性測試結果Table 4 The test result of stability

測定次數n=13，平均值199.89 μg/kg，標準偏差S=6.59 μg/kg，極差=20.92 μg/kg；GB 5009.15-2014《食品安全國家標準食品中鎘的測定》規(guī)定重復性條件下，兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的20%，則兩次測定絕對差（即重復性限r）≤39.98，國標規(guī)定的重復性標準差Sr=r/2.8=14.28，13次測定的重復性臨界極差CrR95（13）=f（13）×Sr=67.12，重復性標準差χ2=（n-1）S2/Sr2=2.56。顯著性水平α=0.05情況下，查表得 χ20.95(12)=21.03，χ2=2.56＜χ20.95(12)，且極差 20.92＜重復性臨界極差CrR95（13），說明該方法測定的穩(wěn)定性標準差和極差均不超過國家標準方法中規(guī)定的重復性要求。

2.5 臺間差

依據LS/T 6402-2017《糧油檢驗設備和方法標準適用性驗證及結果評價一般原則》中6.5的規(guī)定，采用兩臺驗證用設備分別對大米/糙米、小麥和玉米樣品進行雙實驗檢測，取平均值作為檢測結果，并采用配對t檢驗法比較兩臺設備的檢測結果是否存在顯著性差異。根據兩臺設備的檢測結果，用EXCEL函數計算差值Di、D均值、SD和tD，具體數值見表5。

表5 臺間差測試結果Table 5 The test result of inter-instrument agreement

因 tD=1.48，查 t分布表，t0.05，8=2.306，tD＜t0.05，8，tD未超過查表值說明兩臺設備的測定結果之間無顯著性差異，即臺間差滿足檢測要求。

3 結論

該方法前處理過程簡單，非專業(yè)技術人員略加培訓即可操作；檢測速度快，單個樣品檢測時間僅需35 min；無需使用標準品及大量有機試劑，對人員和環(huán)境危害??；測試結果可直接從讀數儀上讀取，消除了人為誤差；整套裝置輕便易攜，檢測成本低，因此具有簡單、快捷、低成本、高效率等優(yōu)點，十分適合糧食收購現(xiàn)場和基層實驗室的快速檢測。另外，該方法的檢出限、定量限、準確性、重復性、穩(wěn)定性和臺間差等參數均滿足LS/T 6402-2017《糧油檢驗設備和方法標準適用性驗證及結果評價一般原則》的要求，故該方法能夠定量測定大米/糙米、小麥和玉米小麥中鎘的含量。基于該方法能夠滿足糧食收購現(xiàn)場對鎘快速定量測定的需求，建議在進一步研究的基礎上，制定膠體金快速定量法測定糧食中鎘的技術規(guī)范或方法標準，使該方法能夠得到推廣應用。