李悅，拜淑娟，高慶超，常應(yīng)九，馬蓉，王樹林，2，*

（1.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海西寧810016；2.青海大學(xué)省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海西寧810016）

黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murr）為茄科枸杞屬多年生多棘刺灌木，主要分布于河湖等沿岸、荒漠河岸等干旱地區(qū)[1]。是我國(guó)西部特有的沙漠藥用植物品種。野生的黑果枸杞具有極強(qiáng)的耐高溫及耐寒性，耐受范圍在38℃到-28℃之間。黑果枸杞中含有大量的花青素、花色苷、氨基酸及礦物質(zhì)成分[2]。然而花青素極其不穩(wěn)定，采用膜濃縮技術(shù)制備花青素可減少花青素在制備過程中的損失[3]。

果汁濃縮，不僅可以減少果汁所占體積，以便于貯藏運(yùn)輸，在濃縮過程中還能發(fā)揮殺菌作用，提高果汁貯藏的穩(wěn)定性[4]。傳統(tǒng)意義上經(jīng)常采用多級(jí)真空蒸發(fā)濃縮果汁，而新鮮果汁風(fēng)味降低、色澤的退化和產(chǎn)生蒸煮味等不良效應(yīng)是導(dǎo)致其無法應(yīng)用于熱敏性果蔬的主要原因[5]。膜濃縮的過程不發(fā)生相變，從而可以保持果汁的芳香味，可以在常溫條件下連續(xù)操作，因而特別適用于果汁中熱敏性物質(zhì)的處理[6]。膜分離過程中因熱效應(yīng)而產(chǎn)生的色素分解和褐變反應(yīng)較少，因而得到的果汁顏色純正、澄清，而其工作溫度與室溫相接近，所以很少需要維護(hù)，可靠性高[7]。反滲透法作為應(yīng)用較為普及的果汁濃縮技術(shù)，通常與微濾超濾等技術(shù)聯(lián)用，應(yīng)用于化工、環(huán)保、生物工程等方面[8-11]。超濾再?gòu)?fù)合膜果汁濃縮中可作為除菌膜使用[12-13]。采用超濾、反滲透的膜分離過程，對(duì)提取的花青素溶液進(jìn)行濃縮，可有效降低濃縮過程中花青素的損耗，在黑果枸杞花青素制備中具有廣泛的應(yīng)用前景。

青海省是黑果枸杞主要產(chǎn)區(qū)，將膜分離技術(shù)應(yīng)用于黑果枸杞花青素制備工藝，可改變黑果枸杞的傳統(tǒng)加工工藝。目前，關(guān)于采用膜濃縮技術(shù)制備黑果枸杞濃縮汁、黑果枸杞花青素的技術(shù)研究處于空白，特別是關(guān)于原料處理、花青素提取液的制備、花青素提取液在膜處理前的處理技術(shù)，適宜的膜類型選擇，膜分離及濃縮工藝等方面的研究沒有任何報(bào)道。本試驗(yàn)利用膜濃縮技術(shù)制備黑果枸杞是為純化所得高濃度花青素做準(zhǔn)備，濃縮純化花青素；主要研究膜濃縮技術(shù)制備黑果枸杞花青素的可行性及其工藝，對(duì)黑果枸杞花青素提取液的制備，膜類型的選擇，膜分離及膜濃縮工藝進(jìn)行探討，為進(jìn)一步的研究及生產(chǎn)中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

黑果枸杞：青海諾木洪地區(qū)；纖維素酶（20000U/g）：寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司；果膠酶（50 000 U/g）：河南萬邦實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 儀器及設(shè)備

PL-G-A1-11-30K聚偏氟乙烯（polyvinglidenefluoride，PVDF）單管膜、陶瓷膜（20 nm）、RO-2540-46N 反滲透濃縮膜；WZS手持式折射儀：上海儀電物理光學(xué)儀器有限公司；ZD-LZ-0.5螺旋榨汁機(jī)：靖江市中德機(jī)械制造廠；板式過濾機(jī)：溫州新派機(jī)械有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

將黑果枸杞干果復(fù)水靜置后榨汁，所得濾渣超聲提取60min。合并濾汁并采用200目網(wǎng)篩過濾以篩除顆粒粒徑大于75mm的雜質(zhì)。采用板式壓濾機(jī)進(jìn)行精濾，以篩除粒徑大于1 μm的雜質(zhì)。經(jīng)超濾分離去除枸杞重的大分子雜質(zhì)以及懸浮性固形物以及部分微生物。微濾清汁經(jīng)反滲透濃縮得到黑果枸杞花青素濃縮液。

1.3.1 試驗(yàn)技術(shù)路線

黑果枸杞干果→復(fù)水→榨汁過濾→酶解澄清單因素實(shí)驗(yàn)→精濾→超濾→反滲透→測(cè)定花色苷的含量。

操作時(shí)，干果復(fù)水按其最佳復(fù)水比，將黑果枸杞復(fù)水浸泡至顆粒充水飽滿擠壓后榨汁，收集所得濾渣采用二次合并的方法使用蒸餾水浸提并超聲（90 W、40 ℃）提取 60 min[14]。最佳復(fù)水比為 1∶6（g/mL），果膠酶最佳使用量為0.06%，纖維素酶最佳使用量為0.01%，酶解最佳溫度：30℃，酶解最優(yōu)時(shí)間：90 min。

1.3.2 最佳復(fù)水比例確定

取5份10 g重黑果枸杞干果分別置于燒杯中，分別以 1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8（g/mL）料液比加入蒸餾水，在常溫下復(fù)水80 min，撈出用吸水紙將復(fù)水枸杞樣品表面水分吸干并稱重，并計(jì)算復(fù)水率確定復(fù)水比[15]。

式中：m2為黑果枸杞干果復(fù)水后果實(shí)總質(zhì)量，g；m1為黑果枸杞干果質(zhì)量，g；

1.3.3 酶解試驗(yàn)最佳單因素條件選定

酶解效果取主要取決于以下4項(xiàng)因素：果膠酶及纖維素酶的添加量、酶解作用時(shí)間以及作用溫度。根據(jù)酶解效果影響因素分別選取5份等量黑果枸杞榨汁粗濾所得粗濾液進(jìn)行試驗(yàn)，單因素選取范圍為：果膠酶添加量：0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.1%；纖維素酶添加量：0.005%、0.01%、0.015%、0.02%、0.025%；酶解作用時(shí)間：60、90、120、150、180min；酶解作用溫度：20、30、40、50、60 ℃。

1.3.4 超濾最佳膜條件選定

將黑果枸杞預(yù)處理汁液投入超濾膜設(shè)備中，控制壓力在0.1MPa條件下，每隔20min測(cè)定一次膜通量，考察在選用 PL-G-A1-11-30K（PVDF）單管膜（20 nm）、陶瓷膜（20 nm）等兩種膜材料時(shí)，黑果枸杞汁流通量、可溶性固形物含量、花青素含量等3項(xiàng)指標(biāo)的變化情況，以確定膜材料的最佳選用情況。使用最佳膜材料進(jìn)行溫度單因素實(shí)驗(yàn)。

料液最佳運(yùn)行溫度的選定：控制壓力于0.1 MPa時(shí)將15 kg黑果枸杞預(yù)處理汁液投入超濾膜設(shè)備中。對(duì)由于在閉路中循環(huán)導(dǎo)致黑果枸杞汁的溫度逐漸上升，在設(shè)備中備有冷凝管，控制料液溫度在（20±3）、（30±3）、（40±3）℃范圍內(nèi)[16]，膜通量每隔 20 min 測(cè)定1次，根據(jù)果汁流通量、可溶性固形物含量以及花青素的含量此3項(xiàng)指標(biāo)綜合考慮選擇最佳超濾溫度。

1.3.5 反滲透最佳條件選定

本試驗(yàn)使用RO-2540-46N反滲透濃縮膜進(jìn)行，將50 kg黑果枸杞汁投入反滲透濃縮設(shè)備中，在閉路中循環(huán)導(dǎo)致黑果枸杞汁的溫度逐漸上升，因此在設(shè)備中配有冷凝裝置以控制料液溫度在（20±3）、（30±3）、（40±3）℃范圍內(nèi)。根據(jù)果汁流通量、可溶性固形物含量以及花青素的含量此3項(xiàng)指標(biāo)綜合考慮選擇最佳濃縮溫度。

選取最佳運(yùn)行溫度進(jìn)行：將50 kg黑果枸杞汁投入反滲透濃縮設(shè)備中，3、3.5、4 MPa對(duì)料液濃縮[14]，濃縮完成后測(cè)定濃縮前后花青素及固含的變化以得到濃縮倍數(shù)，確定最佳濃縮壓力。

1.3.6 試驗(yàn)指標(biāo)測(cè)量方法

花青素測(cè)定采用pH示差法[17]。

式中：A 為（A530-A700）pH1.0-（A530-A700）pH4.5；Mw為分子量，以矢車菊素葡萄糖苷計(jì)，取449.2；Df為稀釋倍數(shù)；ε為摩爾消光系數(shù)，L/（mol·cm），以矢車菊素葡萄糖苷計(jì)，取26 900。

微生物指標(biāo)根據(jù)GB4789.2-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》方法進(jìn)行測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析采用SPSS2.0和Excel軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)水試驗(yàn)結(jié)果分析

黑果枸杞干果復(fù)水試驗(yàn)結(jié)果見圖1。

由圖1可以得到，黑果枸杞的復(fù)水率隨復(fù)水比的增加而增減，但復(fù)水比超過1∶6（g/mL）時(shí)，復(fù)水率開始下降，因此黑果枸杞按照不同料液比在常溫下復(fù)水80min，根據(jù)復(fù)水率的變化情況確定最佳復(fù)水比為1∶6（g/mL）。

圖1 復(fù)水率變化過程Fig.1 Change process of rehydration rate

2.2 酶解效果單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 果膠酶添加量單因素試驗(yàn)

黑果枸杞汁液中果膠酶添加量對(duì)提取液中花青素及可溶性固形物指標(biāo)見表1。

表1 果膠酶添加量影響效果Table 1 The influence of addition for pectinase

由表1可見，果膠酶的添加對(duì)提取液可溶性固形物含量及黑果枸杞花青素都有影響，綜合判斷，黑果枸杞汁中最佳果膠酶最佳添加量為0.06%。

2.2.2 纖維素酶添加量單因素試驗(yàn)

纖維素酶添加量對(duì)提取液中花青素及可溶性固形物含量指標(biāo)見表2。

表2 纖維素酶添加量的影響效果Table 2 The influence of addition for cellulose enzyme

由表2可見，在一定條件下，維素酶添加量為0.01%時(shí)，提取液中可溶性固形物含量達(dá)到最大，此時(shí)花青素含量亦最大，因此黑果枸杞汁中纖維素酶最適添加量為0.01%。

2.2.3 酶解時(shí)間單因素試驗(yàn)最佳條件選定

不同酶解時(shí)間對(duì)黑果枸杞中花青素含量、可溶性固形物含量的影響結(jié)果見表3。

表3 酶解時(shí)間的影響Table 3 The influence of enzyme time for enzymatic hydrolysis

由表3可見，在一定條件下，酶解時(shí)間為90 min時(shí)，可達(dá)到最大花青素及可溶性固形物含量水平，因此黑果枸杞汁中最佳酶解時(shí)間為90 min。

2.2.4 酶解溫度單因素試驗(yàn)最佳條件選定

不同酶解溫度對(duì)黑果枸杞中花青素含量、可溶性固形物含量的影響結(jié)果見表4。

表4 酶解溫度的影響效果Table 4 The influence of temperature for enzymatic hydrolysis

由表4可見，在一定條件下，酶解溫度為30℃時(shí)，提取液中黑果枸杞花青素含量、可溶性固形物含量達(dá)到最大，因此黑果枸杞汁中最佳酶解溫度為30℃。

2.3 影響超濾效果的單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.3.1 膜材料的選擇對(duì)超濾效果的影響結(jié)果分析

不同膜材料對(duì)料液流通量、過濾濾液中花青素及可溶性固形物含量的影響見圖2、圖3及表5。

由圖2、圖3和表5可以看出，兩種孔徑相同材質(zhì)不同的膜材料在超濾過程中對(duì)濾液中可溶性固形物含量和花青素透過量基本沒有影響，但陶瓷膜料液流通量明顯高于PVDF膜材料，由此選用陶瓷膜材料作為超濾膜。

2.3.2 不同溫度對(duì)超濾效果的影響結(jié)果分析

不同溫度對(duì)超濾后濾液的中花青素含量的影響結(jié)果見圖4。

圖2 PVDF不同溫度料液流通量變化過程Fig.2 The change process of the circulation of PVDF at different temperatures

圖3 陶瓷膜不同溫度料液流通量變化過程Fig.3 Change process of the circulation of ceramic memebrane at different temperature

表5 不同材質(zhì)的超濾膜對(duì)超濾效果的比較Table 5 The effect of ultrafiltration for different materials membrane

圖4 不同超濾溫度下對(duì)花青素含量變化圖Fig.4 Effects of different temperatures on the content of anthocyanins

由圖3、圖4可以看出，隨著溫度逐漸升高，料液流通量、濾液中花青素含量也隨即增大；根據(jù)可溶性固形物含量、料液流通量可以得出，壓力為0.1 MPa運(yùn)用陶瓷膜材質(zhì)的超濾膜試驗(yàn)中，確定過膜溫度為40℃。

2.3.3 超濾前后黑果枸杞汁菌落總數(shù)變化量

由表6可以看出，超濾前果汁溶液與超濾后清液中菌落總數(shù)含量差達(dá)到3個(gè)數(shù)量級(jí)，達(dá)到一定程度的滅菌作用。

表6 超濾前后黑果枸杞菌落總數(shù)變化情況Table 6 Total number of Lycium ruthenicum Murr colonies before and after ultrafiltration CFU/mL

2.4 影響反滲透濃縮效果的單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.4.1 反滲透濃縮溫度單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.4.1.1 不同溫度對(duì)反滲透過程膜通量的影響

不同溫度對(duì)反滲透過程中膜通量的影響見圖5。

圖5 反滲透料液流通量變化過程Fig.5 Flow change process of hyperfiltration liquid

2.4.1.2 不同溫度對(duì)反滲透過程中花青素含量的影響

不同溫度對(duì)反滲透過程中花青素含量的影響見圖6。

圖6 反滲透料液花青素含量變化情況Fig.6 Change process of anthocyanin content in hyperfiltration liquid

2.4.1.3 不同溫度對(duì)反滲透過程中可溶性固形物含量的影響

不同溫度對(duì)反滲透過程中可溶性固形物含量的影響見圖7。

由圖5、圖6、圖7可以看出，溫度與枸杞濃汁流通量呈正相關(guān)，而花青素保留率與溫度變化呈負(fù)相關(guān)?；ㄇ嗨睾吭?0℃操作條件下達(dá)到最佳保留率。應(yīng)根據(jù)具體工作要求選擇反滲透溫度。

圖7 反滲透料液可溶性固形物變化情況Fig.7 Flow change process of total soluble solid

2.4.2 不同壓力對(duì)反滲透濃縮的影響結(jié)果分析

2.4.2.1 40℃時(shí)不同壓力在反滲透中對(duì)膜通量的影響40℃時(shí)不同壓力在反滲透中對(duì)膜通量的影響見圖8。

圖8 反滲透料液流通量變化情況Fig.8 Flow change process of hyperfiltration liquid

2.4.2.2 不同壓力在反滲透過程種對(duì)花青素含量的影響結(jié)果

不同壓力在反滲透過程種對(duì)花青素含量的影響結(jié)果見圖9。

圖9 反滲透料液花青素含量變化情況Fig.9 Change process of anthocyanin content in hyperfiltration liquid

2.4.2.3 不同壓力在反滲透過程種對(duì)可溶性固形物含量的影響結(jié)果

不同壓力在反滲透過程種對(duì)可溶性固形物含量的影響結(jié)果見圖10。

圖10 反滲透料液可溶性固形物變化情況Fig.10 Flow change process of total soluble solid

由圖8、圖9、圖10可以看出，在溫度為40℃時(shí)，當(dāng)反滲透壓力為4.0MPa時(shí)，濃縮倍數(shù)最大，可達(dá)到3.62倍，也就是濃縮液中花青素的含量為原液的3.62倍。

2.4.3 反滲透前后黑果枸杞汁菌落總數(shù)變化量

由表7可以看出，反滲透前果汁溶液與反滲透后黑果枸杞濃縮汁中菌落總數(shù)含量差達(dá)到1個(gè)數(shù)量級(jí)。根據(jù)微生物變化情況可以得到超濾反滲透連用可以有效減少微生物含量，是較好的熱敏性物質(zhì)殺菌方式。

表7 反滲透前后黑果枸杞菌落總數(shù)變化情況Table 7 Total number of Lycium ruthenicum Murr colonies before and after reverse osmosis concentration CFU/mL

3 討論

黑果枸杞中花青素極其不穩(wěn)定，存在見光易分解，遇高溫易降解等問題，因而在研究黑果枸杞生產(chǎn)工藝過程中使花青素含量得到最大保留是目前著重研究?jī)?nèi)容。本試驗(yàn)采用膜濃縮技術(shù)制備黑果枸杞花青素提取濃縮液濃縮果汁，避免了傳統(tǒng)濃縮過程中高溫處理過程，有效保存了提取液中的花青素在濃縮過程中的損失。并且在濃縮過程中，超濾過程可除去大量微生物，反滲透過程則使高濃度花青素汁以有效避免微生物的滋生，可達(dá)到一定程度上的抑菌作用。

試驗(yàn)分為膜濃縮前預(yù)處理階段和膜濃縮階段，以花青素含量、可溶性固形物含量為指標(biāo)，比較超濾-反滲透工藝前后花青素和固含物的質(zhì)量。膜濃縮前處理階段主要研究復(fù)水試驗(yàn)及酶解工藝[18-20]，酶解前花青素含量為2 003.59 mg/L，酶解后花青素含量為1 936.98 mg/L，優(yōu)選最佳酶解工藝條件。黑果枸杞汁液進(jìn)行超濾試驗(yàn)選用陶瓷膜材料，壓力為0.1 MPa，在T=20℃，可溶性固含物變化范圍6%～10%；T=30℃，可溶性固形物含量變化范圍5.5%～9.5%；T=40℃，可溶性固含物變化范圍5.5%～10%；超濾溫度為40℃時(shí)，通過圖表判斷得出超濾后黑果枸杞清汁中花青素含量有所降低，分析原因：長(zhǎng)時(shí)間的高溫會(huì)使花青素發(fā)生一定程度的降解。并且在運(yùn)行過程中，由于機(jī)械放熱也會(huì)使料液溫度有所升高，所以實(shí)際生產(chǎn)操作中控制溫度在30℃～40℃，以確?；ㄇ嗨氐姆€(wěn)定和最低損失率。反滲透初始可溶性固形物含量為6 Brix°所得濃縮液中可溶性固形物含量可達(dá)20%；在溫度為40℃，壓力為4 MPa時(shí)濃縮效果最好，最后制得的黑果枸杞果汁濃縮倍數(shù)達(dá)到3.62倍；在實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)中，選用4 MPa壓力進(jìn)行濃縮時(shí)，膜流通量最大；而在試驗(yàn)相關(guān)研究?jī)?nèi)容中，為得到高濃度花青素含量，選用3.5 MPa壓力最佳。由于可溶性固形物含量為20%的濃縮液在試驗(yàn)過程中采用的反滲透濃縮膜中已經(jīng)無法繼續(xù)進(jìn)行反滲透濃縮過程，達(dá)到濃縮極限，得到最大濃縮倍數(shù)。

膜濃縮技術(shù)已應(yīng)用于果汁澄清及過濾等方面，能大規(guī)模生產(chǎn)從而降低生產(chǎn)成本。目前膜濃縮技術(shù)也存在許多亟待解決的問題，例如：（1）由于濃差極化現(xiàn)象而導(dǎo)致隨著膜過濾時(shí)間的推移，膜通量會(huì)大幅度降低，分離效率降低，從而導(dǎo)致濃縮程度大大受限；（2）適用范圍有限，耐高溫腐蝕性能不強(qiáng)；（3）膜污染嚴(yán)重，且清洗困難；（4）成本高，要廣泛地應(yīng)用于果汁的工業(yè)化生產(chǎn)比較困難[5]。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)主要研究超濾-反滲透膜濃縮技術(shù)制備黑果枸杞花青素提取物，膜濃縮前對(duì)黑果枸杞干果原料進(jìn)行預(yù)處理，適宜的復(fù)水比有助于提高黑果枸杞干果的復(fù)水率，復(fù)水后榨汁過濾，通過添加酶制劑可以有效提高提取液的花青素含量，并有利于提高膜過濾通量。選用適宜的膜材料，采用適宜的膜過濾及反滲透工藝，可對(duì)黑果枸杞提取液進(jìn)行濃縮，有助于黑果枸杞花青素濃縮的制備，并能有效降低黑果枸杞濃縮汁的微生物含量，是一種面向花青素等熱敏物質(zhì)的高效冷殺菌技術(shù)。由于膜分離過程中料液溫度較低，有利于花青素的保留，是一種較為先進(jìn)的分離制備工藝，此研究結(jié)果有助于進(jìn)一步探索膜技術(shù)在黑果枸杞花青素制備中的應(yīng)用。