張婷婷，張賓樂，廖秀玲，廖素蘭

（1.武夷學(xué)院茶與食品學(xué)院，福建武夷山354300；2.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇無錫214122）

武夷巖茶是深受國人們喜愛的茶類，是中國烏龍茶的珍品[1]，屬于中國十大名茶之一。茶葉中含有豐富的氨基酸，是構(gòu)成茶葉滋味的重要成分，也是武夷巖茶品質(zhì)鑒定中的一個重要理化指標(biāo)，直接影響茶葉的品質(zhì)[2]。茶葉的游離氨基酸（free amino acids，F(xiàn)AA）指茶葉水浸出物中呈游離狀態(tài)存在，非蛋白質(zhì)態(tài)的可溶性氨基酸[3]，其含量對武夷巖茶的滋味、香氣、藥理和營養(yǎng)作用等有很大的影響[4]。武夷巖茶在制作過程中，挑選出成品茶后會剩余大量的粗老葉、茶梗等下腳料，造成環(huán)境污染[5]。其中粗老葉的營養(yǎng)價值及風(fēng)味成分最多，只略低于成品茶，因此被丟棄過于浪費。傳統(tǒng)的普通浸提法很難完全浸提出茶葉中的營養(yǎng)成分和風(fēng)味物質(zhì)，且高溫提取會使茶葉中很多風(fēng)味物質(zhì)揮發(fā)，失去香氣。由于浸提條件很大程度上影響著茶葉浸出物的色、香、味等品質(zhì)[6]，近年來，一些物理浸提技術(shù)逐漸成熟，如微波浸提、超聲波浸提，超高壓浸提等，但由于成本較高，因此目前國內(nèi)更側(cè)重采用化學(xué)提取法或物理化學(xué)結(jié)合的方法浸提茶湯[7]。酶制劑用于速溶茶生產(chǎn)時茶湯的浸提，具有高效、節(jié)能、環(huán)保等特點[8]。纖維素酶能分解茶葉細胞壁，使細胞結(jié)構(gòu)破壞，從而促進茶葉中有效成分的擴散和浸出，有利于固形物的溶出和浸提率的提高；蛋白酶能水解茶葉中的蛋白質(zhì)，能提高茶湯中的氨基酸含量，增強茶湯鮮爽的口感[9]，將這兩種酶復(fù)合提取可起到事半功倍的效果。因此，該試驗選用武夷巖茶的粗老葉為原料，采用復(fù)合酶法浸提，以水提物中游離氨基酸總量為考察指標(biāo)，篩選最優(yōu)的浸提工藝參數(shù)，提高水提液的營養(yǎng)價值及風(fēng)味，為下一步茶飲料、速溶茶粉等茶產(chǎn)品的生產(chǎn)和研發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

武夷巖茶下腳料（粗老葉）：武夷山清風(fēng)澗巖茶廠；纖維素酶（5×104U/g）：寧夏和氏璧生物工程有限公司；木瓜蛋白酶（1×105U/g）：南寧龐博生物工程有限公司；茶氨酸標(biāo)準品、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、水合茚三酮、氯化亞錫（均為分析純）：上海展云化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PW80萬能高速粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司；AR522CN電子分析天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司；HH-4恒溫水浴鍋：金壇市鴻科儀器廠；SHZ-DIII循環(huán)式真空水泵：鞏義市予華儀器有限公司；V-1100D型可見分光光度計：上海美譜達儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

巖茶粗老葉→粉碎→加酶浸提→滅酶→抽濾→水提液→理化測定

1.3.2 操作要點

1）粉碎：取一定量的巖茶粗老葉，粉碎至一定細度，過40目篩備用；

2）加酶浸提：稱取2.000 g過篩的茶碎末于250 mL錐形瓶中，加入一定量蒸餾水、纖維素酶和木瓜蛋白酶。調(diào)節(jié)pH值為7，置于恒溫水浴鍋中，控制一定溫度和時間進行浸提；

3）滅酶：至于100℃恒溫水浴鍋中滅酶5 min；

4）抽濾：將酶解液真空抽濾，分離出茶渣，將得到的水提物移到100 mL的容量瓶中，用蒸餾水定容，搖勻待測。

1.3.4 游離氨基酸總量的測定

采用GB/T8314-2013《茶游氨基酸總量的測定》[10]中的茚三酮比色法，繪制氨基酸標(biāo)準曲線，并測定水提液中的游離氨基酸總量。

1.3.5 單因素試驗設(shè)計

1.3.5.1 纖維素酶與木瓜蛋白酶復(fù)配比例的確定

纖維素酶與木瓜蛋白酶分別以酶活力比1∶9、3∶7、5 ∶5、7 ∶3、9 ∶1（U/U）復(fù)配。其余參數(shù)為：總加酶量500 U/g、浸提時間40 min、浸提溫度50℃和料液比1∶15（g/mL）。

1.3.5.2 總加酶量的確定

總加酶量分別設(shè)定為 250、500、750、1000、1250 U。其余參數(shù)為：纖維素酶與木瓜蛋白酶以酶活力5∶5（U/U）復(fù)配、浸提時間40 min、浸提溫度50℃和料液比1∶15（g/mL）。

1.3.5.3 浸提溫度的確定

浸提溫度分別設(shè)定在 30、40、50、60、70℃。其余參數(shù)為：纖維素酶與木瓜蛋白酶以酶活力比5∶5（U/U）復(fù)配、總加酶量500 U、浸提時間40 min和料液比1∶15（g/mL）。

1.3.5.4 浸提時間的確定

浸提時間分別設(shè)定為 10、20、30、40、50 min。其余參數(shù)為：纖維素酶與木瓜蛋白酶以酶活力比5∶5（U/U）復(fù)配、總加酶量500 U、浸提溫度50℃和料液比1∶15（g/mL）。

1.3.5.5 料液比的確定

料液比分別設(shè)定為 1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25（g/mL）和1∶30（g/mL）。其余參數(shù)為：纖維素酶與木瓜蛋白酶以酶活力比5∶5（U/U）復(fù)配、總加酶量500 U、浸提時間40 min和浸提溫度50℃。

1.3.6 正交試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取較優(yōu)的因素水平范圍，設(shè)計四因素三水平正交試驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨基酸標(biāo)準曲線

以氨基酸（以茶氨酸計）濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準曲線，如圖1所示。

圖1 氨基酸標(biāo)準曲線Fig.1 Amino acid standard curve

如圖1所示，線性回歸方程為：y=2.984x-0.067 8，R2=0.998 8，茶氨酸對照品吸光值與其濃度線性關(guān)系良好。

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 復(fù)合酶配比對FAA總量的影響

以纖維素酶與木瓜蛋白酶的復(fù)配比例為橫坐標(biāo)，F(xiàn)AA總量為縱坐標(biāo)，繪制柱形圖，如圖2所示。

圖2 復(fù)合酶配比對水提液中FAA總量的影響Fig.2 Effect of compound enzyme ratio on total FAA content in water extract

纖維素酶通過分解植物的細胞壁從而釋放其中的有效成分，木瓜蛋白酶對其中蛋白質(zhì)進行水解。茶葉中蛋白質(zhì)含量約占其干物質(zhì)含量的15%～30%，絕大多數(shù)為非水溶性蛋白，而水溶性蛋白只占2%[11-12]。這兩種酶復(fù)合，會對相互的酶解反應(yīng)產(chǎn)生增效作用。由圖2可知，當(dāng)復(fù)合酶配比（U/U）為5∶5時，水提液中游離氨基酸總量最高。游離氨基酸的產(chǎn)生主要依靠蛋白酶對茶葉中水溶性和非水溶性蛋白的降解，蛋白酶含量不足，則降解產(chǎn)物——游離氨基酸總量下降。而纖維素酶分解茶葉的細胞壁，能有助于茶葉中非水溶性蛋白暴露，被蛋白酶降解，因此，纖維素含量不足，游離氨基酸總量也下降。綜上所述，纖維素與木瓜蛋白酶的最佳復(fù)配比例為酶活力比5∶5（U/U）。

2.2.2 總加酶量對FAA總量的影響

以總加酶量為橫坐標(biāo)，F(xiàn)AA總量為縱坐標(biāo)，繪制曲線圖，如圖3所示。

圖3 總加酶量對水提液中FAA總量的影響Fig.3 Effect of total enzymatic addition on total FAA content in water extract

由圖3可知，隨著加酶量的增加，游離氨基酸總量逐漸升高。當(dāng)總加酶量為250 U～1 000 U時，游離氨基酸總量明顯上升，說明在這個區(qū)域內(nèi)，底物分子與酶有很好的結(jié)合度，隨著加酶量的升高，酶解產(chǎn)物增多。當(dāng)加酶量為1 000 U時，游離氨基酸總量接近最高值，大于1 000 U之后，游離氨基酸總量無明顯上升，這是由于加酶量已經(jīng)超出了底物濃度，再增加亦對酶解反應(yīng)也無明顯作用。因此，從成本考慮，總加酶量在1 000 U為宜。

2.2.3 浸提溫度對FAA總量的影響

以浸提溫度為橫坐標(biāo)，F(xiàn)AA總量為縱坐標(biāo)，繪制曲線圖，如圖4所示。

圖4 浸提溫度對水提液中FAA總量的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on total FAA content in water extract

酶在最適溫度范圍內(nèi)活性最強，酶促反應(yīng)速度最快，且資料表明纖維素酶與木瓜蛋白酶的最適溫度范圍相近[13-14]，因此該試驗直接對復(fù)合酶的最適溫度作研究。由圖4可知，當(dāng)溫度低于50℃時，酶活性被抑制，隨著溫度升高，游離氨基酸總量逐漸上升，達到50℃時游離氨基酸總量最高。超過50℃時，酶活性下降，曲線明顯下降，且溫度過高，酶屬于蛋白質(zhì)，易發(fā)生變性。因此，該復(fù)合酶的最佳酶解溫度在50℃為宜。

2.2.4 浸提時間對FAA總量的影響

以浸提時間為橫坐標(biāo)，F(xiàn)AA總量為縱坐標(biāo)，繪制曲線圖，如圖5所示。

圖5 浸提時間對水提液中FAA總量的影響Fig.5 Effect of extraction time on total FAA content in water extract

由圖5可知，隨著浸提時間的延長，游離氨基酸總量逐漸上升，在20 min前，上升速度較快，這說明游離氨基酸分子質(zhì)量較小，能夠很快的溶出[15]；20 min后，游離氨基酸總量上升緩慢，說明20 min對于大部分的底物能夠與復(fù)合酶發(fā)生酶解反應(yīng)，20 min后繼續(xù)酶解浸提，游離氨基酸總量雖仍在上升，但速率開始減緩。因此從成本考慮，浸提時間以20 min為宜。

2.2.5 料液比對FAA總量的影響

以料液比為橫坐標(biāo)，F(xiàn)AA總量為縱坐標(biāo)，繪制柱形圖，如圖6所示。

圖6 料液比對水提液中FAA總量的影響Fig.6 Effect of the ratio of material to liquid on total FAA content in water extract

料液比對水提液中FAA的影響表現(xiàn)為：一方面隨著溶劑的增加，有助于溶質(zhì)FAA的浸出，但另一方面若溶劑過多，會對底物和酶起到稀釋作用，而降低酶解反應(yīng)的速率。由圖6的試驗結(jié)果可以看出，在料液比 1∶25（g/mL）前，隨著溶劑的增加，F(xiàn)AA 在水提液中的浸出量逐漸上升；料液比 1∶10（g/mL）時，浸提出的FAA總量最低，此時底物濃度偏高，酶不足以充分與底物結(jié)合；當(dāng)料液比為1∶25（g/mL）時，底物與酶的濃度相當(dāng)，降解出的游離氨基酸總量最高；溶劑繼續(xù)增加，則底物和復(fù)合酶被稀釋，酶解速率下降，游離氨基酸總量下降，因此最佳料液比以1∶25（g/mL）為宜。

2.3 正交試驗結(jié)果

根據(jù)單因素試驗得出的結(jié)果，從中選取最優(yōu)的因素水平范圍，做進一步優(yōu)化，設(shè)計正交試驗表，如表1所示。

表1 L9（34）正交試驗設(shè)計表Tabel 1 L9（34）orthogonal experimental design table

根據(jù)表1的正交設(shè)計進行組合試驗，得出的試驗結(jié)果如表2所示。

表2 L9（34）正交試驗結(jié)果Tabel 2 L9（34）orthogonal experimental results

由表2的正交試驗結(jié)果可知，對試驗結(jié)果影響的顯著性由高到低依次為：C（酶解時間）>D（料液比）>A（總加酶量）>B（酶解溫度）。根據(jù)k值篩選出最優(yōu)的浸提工藝組合為A2B2C3D1，即總加酶量1 000 U；酶解溫度 50 ℃；酶解時間 25 min；料液比 1∶22（g/mL），該組合恰好為正交試驗組合的第5組。因此，采用正交優(yōu)化的最優(yōu)工藝浸提巖茶粗老葉，得到的水提液中游離氨基酸含量為26.97%。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

本研究得出了采用木瓜蛋白酶和纖維素酶兩種酶復(fù)合，從武夷巖茶下腳料——粗老葉中浸提高含量游離氨基酸水提液的最優(yōu)工藝。得到的水提液中游離氨基酸含量為26.97%，與傳統(tǒng)的水浴加熱或超聲輔助法等相比[16]，顯著提高了游離氨基酸的溶出率，有助于提高茶產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟效益。

3.2 討論

早年就有關(guān)于速溶茶的酶法提取工藝研究，但發(fā)展較慢，如今酶在各行業(yè)都被廣泛應(yīng)用和關(guān)注，因此今后速溶茶的發(fā)展勢必會向著酶法提取技術(shù)研究靠攏[17]。

本試驗采用纖維素酶和木瓜蛋白酶的復(fù)合酶從武夷巖茶下腳料——粗老葉中酶解浸提水提物，先采用纖維素酶分解茶葉細胞壁中的纖維素，生成水溶性糖，并使細胞內(nèi)容物更好地釋放出來，再利用蛋白酶分解其中的蛋白質(zhì)，產(chǎn)生水溶性氨基酸，浸出至茶湯中，更大程度地保留了茶葉的營養(yǎng)成分和風(fēng)味物質(zhì)。游離氨基酸是影響茶飲品的風(fēng)味和營養(yǎng)價值的主要物質(zhì)，本研究是為武夷巖茶及其下腳料的浸提工藝研究提供了參考，對提高茶產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟效益及下一步的高氨基酸茶飲品、速溶茶粉等茶產(chǎn)品的生產(chǎn)和研發(fā)提供參考依據(jù)。