鞠林成， 史亞興， 張輝， 宋永勝， 殷波

腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma，RCC)是起源于腎小管上皮的惡性腫瘤，其發(fā)病率逐年增高[1]。腎透明細(xì)胞癌(clear cell renal cell carcinoma，ccRCC)是腎癌中最常見(jiàn)的病理類型，占腎癌的75%～80%，男性發(fā)病率高于女性[2]。腎透明細(xì)胞癌早期診斷困難，發(fā)現(xiàn)時(shí)多數(shù)需行根治性腎切除術(shù)，同時(shí)腎透明細(xì)胞癌對(duì)常規(guī)放化療不敏感，一旦轉(zhuǎn)移往往預(yù)后不佳。因此，研究腎透明細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制有著重要的意義，探索新的分子診斷標(biāo)記物對(duì)腎透明細(xì)胞癌的早期診斷、疾病進(jìn)展乃至尋找新的抑制靶點(diǎn)有重要幫助。連環(huán)蛋白δ(δ-catenin)是連環(huán)蛋白家族中的一員，已知連環(huán)蛋白-δ與前列腺癌、乳腺癌以及非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3-5]。本研究旨在分析連環(huán)蛋白δ在RCC中的表達(dá)及意義，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年2月—2017年4月中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院泌尿外科收治的腎透明細(xì)胞癌101患者例作為研究對(duì)象，均行腎部分切除術(shù)或根治性腎切除術(shù)且術(shù)后病理檢查確診，術(shù)前均未行放、化療或腫瘤相關(guān)治療。101例中男63例，女38例，年齡29～86歲，中位年齡57.5歲；體檢發(fā)現(xiàn)86例，因腰痛行影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)9例，因血尿行影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)6例；合并高血壓22例，糖尿病13例，貧血7例；肺轉(zhuǎn)移4例。腫瘤組織病理學(xué)分級(jí)采用Fuhrman分類[2]：Ⅰ級(jí)9例,Ⅱ級(jí)45例，Ⅲ級(jí)33例，Ⅳ級(jí)14例。腫瘤T分期采用美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)(American Joint Committee on Cancer，AJCC)的TNM腎癌分期[6]：T1期49例，T2期25例，T3期17例，T4期10例。另選取距腫瘤邊緣≥2 cm的癌旁腎組織53例作為對(duì)照組。

1.2 檢測(cè)指標(biāo)與方法 采用鏈霉素抗生物素蛋白過(guò)氧化物酶法(SP)檢測(cè)連環(huán)蛋白-δ蛋白的表達(dá)以及其與各種臨床病理參數(shù)間的關(guān)系。組織標(biāo)本由中性福爾馬林固定、石蠟包埋再制成4 μm連續(xù)切片(石蠟切片機(jī)，德國(guó)萊卡公司)，切片以二甲苯脫蠟及梯度酒精水化，經(jīng)檸檬酸鹽抗原修復(fù)液(pH=6.0)高壓下抗原修復(fù)，再以3%過(guò)氧化氫浸泡20 min滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，非免疫血清封閉。然后將切片與鼠抗人單克隆抗體連環(huán)蛋白-δ (1∶100，美國(guó)SANTA CRUZ生物公司)在4℃條件下溫育過(guò)夜。磷酸緩沖液(PBS)代替一抗做陰性對(duì)照。免疫組化染色的評(píng)分參照如下標(biāo)準(zhǔn):以細(xì)胞漿呈棕黃色者為陽(yáng)性細(xì)胞，選取腫瘤細(xì)胞染色陽(yáng)性集中的區(qū)域，在高倍視野(×400)下每張切片計(jì)數(shù)400個(gè)腫瘤細(xì)胞的染色情況。按染色強(qiáng)度分為4個(gè)等級(jí)：無(wú)染色計(jì)0分，淺黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，黃褐色計(jì)3分；按表達(dá)百分率分4個(gè)等級(jí)：1%～25%計(jì)1分，26%～50%計(jì)2分，51%～75%計(jì)3分，>75%計(jì)4分。將陽(yáng)性細(xì)胞率和染色強(qiáng)度得分值乘積計(jì)算為每例的積分(0～12分)，將評(píng)分結(jié)果歸為陰性表達(dá)(0～3分)和陽(yáng)性表達(dá)(≥4分)2組。

2 結(jié) 果

2.1 連環(huán)蛋白-δ表達(dá)比較 腎透明細(xì)胞癌患者101例癌組織中連環(huán)蛋白-δ陽(yáng)性表達(dá)68例(67.3%)，高于癌旁組織53例中連環(huán)蛋白-δ陽(yáng)性表達(dá)14例(26.4%)(χ2=23.370,P<0.05)。圖1見(jiàn)封3。

2.2 臨床各參數(shù)與連環(huán)蛋白-δ陽(yáng)性表達(dá)的相關(guān)性分析 連環(huán)蛋白-δ陽(yáng)性表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌不同T分期、病理分級(jí)呈正相關(guān)，與患者性別、年齡、腫瘤側(cè)別及腫瘤最大徑均無(wú)相關(guān)性(P>0.05)，見(jiàn)表1。進(jìn)一步應(yīng)用二元Logistic分析結(jié)果顯示，連環(huán)蛋白-δ的陽(yáng)性表達(dá)僅與腫瘤患者的病理分級(jí)有顯著相關(guān)性(P=0.013)，見(jiàn)表2。

表1 68例腎透明細(xì)胞癌臨床特征及 病理與連環(huán)蛋白-δ陽(yáng)性表達(dá)相關(guān)性

表2 二元Logistic分析連環(huán)蛋白-δ與 腎透明細(xì)胞癌臨床病理參數(shù)的相關(guān)性

2.3 連環(huán)蛋白-δ陽(yáng)性表達(dá)在腎透明細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展中的作用 I級(jí)腎透明細(xì)胞癌中連環(huán)蛋白-δ的陽(yáng)性表達(dá)率為22.2%(2/9)，II級(jí)腎透明細(xì)胞癌中連環(huán)蛋白-δ的陽(yáng)性表達(dá)率為60.0%(27/45)，III級(jí)腎透明細(xì)胞癌中連環(huán)蛋白-δ的陽(yáng)性表達(dá)率為78.8%(26/33)，IV級(jí)腎透明細(xì)胞癌中連環(huán)蛋白-δ的陽(yáng)性表達(dá)率為92.9%(13/14)。結(jié)果表明，腎透明細(xì)胞癌的病理分級(jí)越高，連環(huán)蛋白-δ的陽(yáng)性表達(dá)越強(qiáng)烈。腎透明細(xì)胞癌的病理分級(jí)ROC曲線下面積為0.714，約登指數(shù)最大時(shí)(0.331)對(duì)應(yīng)病理分級(jí)值>2，此時(shí)連環(huán)蛋白-δ陽(yáng)性表達(dá)的敏感度為0.574，特異度為0.758。見(jiàn)圖2，表3。

圖2 腎透明細(xì)胞癌病理分級(jí)的ROC曲線

病理分級(jí)敏感度95% CI特異度95% CI約登指數(shù)01.0000.947～1.0000.0000.000～0.1060.000 1.50.9710.898～0.9960.2120.090～0.3890.183 2.50.5740.448～0.6930.7580.577～0.8890.331 3.50.1910.106～0.3050.9700.842～0.9990.161 5.00.0000.000～0.0531.0000.894～1.0000.000

3 討 論

連環(huán)蛋白-δ屬p120連環(huán)蛋白家族成員，有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道p120連環(huán)蛋白家族成員多參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[7]。連環(huán)蛋白-δ作為p120家族的成員之一，有關(guān)其最早的研究是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在大腦發(fā)育過(guò)程中，連環(huán)蛋白-δ在上皮細(xì)胞與神經(jīng)元的黏附連接處有很強(qiáng)的表達(dá)，可以促進(jìn)突觸生長(zhǎng)[8-9]。近來(lái)研究指出連環(huán)蛋白-δ能夠通過(guò)近膜結(jié)構(gòu)域(juxta membrane domain，JMD)與細(xì)胞膜上的鈣黏蛋白E(E-cadherin)結(jié)合形成E-cadherin/catenin復(fù)合體促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的惡性表型，而且連環(huán)蛋白-δ還可以通過(guò)影響小GTP酶的活性影響腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移[5]。另外，連環(huán)蛋白-δ在一些腫瘤中的陽(yáng)性表達(dá)與TNM分期、病理分級(jí)及不良的臨床預(yù)后密切相關(guān)[10-11]。但連環(huán)蛋白-δ在腎透明細(xì)胞癌中表達(dá)情況鮮有報(bào)道。本項(xiàng)研究結(jié)果顯示，連環(huán)蛋白-δ在腎透明細(xì)胞癌中的陽(yáng)性表達(dá)與性別、年齡、側(cè)別、腫瘤最大徑及TNM分期均無(wú)相關(guān)性，僅與腎透明細(xì)胞癌的病理分級(jí)呈正相關(guān)，提示連環(huán)蛋白-δ陽(yáng)性表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌的進(jìn)展存在聯(lián)系。

腎癌的Fuhrman病理分級(jí)是目前應(yīng)用最為廣泛的分級(jí)系統(tǒng)，也被認(rèn)為是預(yù)測(cè)腎癌預(yù)后的獨(dú)立因子[2,12]，較高的Fuhrman病理分級(jí)預(yù)示著較差的臨床預(yù)后。本研究采用ROC分析并得出最佳切點(diǎn)對(duì)應(yīng)的病理分級(jí)值>2，提示在病理分級(jí)為III級(jí)或IV級(jí)的腎透明細(xì)胞癌患者中，連環(huán)蛋白-δ的陽(yáng)性表達(dá)更具有臨床意義即不良的臨床預(yù)后，這預(yù)示連環(huán)蛋白-δ是腎透明細(xì)胞癌預(yù)后不良的一個(gè)潛在的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。文獻(xiàn)報(bào)道，連環(huán)蛋白-δ可以通過(guò)影響Rac1、Cdc42與RhoA等小GTP酶的活性促進(jìn)淋巴管生成及腫瘤轉(zhuǎn)移，在前列腺癌、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)連環(huán)蛋白-δ的陽(yáng)性表達(dá)與小GTP酶有關(guān)，連環(huán)蛋白-δ的陽(yáng)性表達(dá)可促進(jìn)癌細(xì)胞從G1期到S和G2/M期的細(xì)胞周期，顯著增加腫瘤細(xì)胞的增殖促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展，連環(huán)蛋白-δ還可以進(jìn)入細(xì)胞核并且與轉(zhuǎn)錄抑制因子Kaiso結(jié)合，從而緩解cyclin D1的轉(zhuǎn)錄抑制作用[13-16]。同時(shí)，小GTP酶又是細(xì)胞骨架重構(gòu)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表達(dá)通路的重要調(diào)節(jié)因子[17]。因此，我們推斷連環(huán)蛋白-δ可能通過(guò)影響小GTP酶活性、調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重塑促進(jìn)腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞的侵襲增殖能力，以及改變細(xì)胞周期等方式影響腎透明細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展。其確切機(jī)制需在腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞系中進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究觀察到連環(huán)蛋白-δ在腎透明細(xì)胞癌組織中呈顯著陽(yáng)性表達(dá)，并且與腎透明細(xì)胞癌的病理分級(jí)存在正相關(guān)性，與腎透明細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展的生物學(xué)行為有著密切的聯(lián)系。預(yù)示連環(huán)蛋白-δ可作為預(yù)測(cè)腎透明細(xì)胞癌臨床預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，有可能成為腎透明細(xì)胞癌診斷及治療的新靶點(diǎn)，為進(jìn)一步深入研究腎透明細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制提供了依據(jù)。

利益沖突：無(wú)

作者貢獻(xiàn)聲明

鞠林成：收集病例，整理資料，撰寫(xiě)文章，修改論文；史亞興：參與設(shè)計(jì)圖表，搜集數(shù)據(jù)，參與論文修改；張輝：研究構(gòu)思，參與設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)步驟；宋永勝：實(shí)施設(shè)計(jì)課題，審核文章；殷波：統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，查找參考文獻(xiàn)，對(duì)文章撰寫(xiě)提出指導(dǎo)意見(jiàn)并參與文章撰寫(xiě)