潘懿,霍秀龍,韋顯凱
(1.百色市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局廣西百色 533300;2.平果縣動物疫病預(yù)防控制中心廣西百色 531400;3.廣西壯族自治區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心南寧 530001)
RABV(狂犬病毒)蛋白質(zhì)占74%,其中N 蛋白占36%[1],N 蛋白具有五個(gè)方面特性:①變異幾率較底,穩(wěn)定性高;②與病毒免疫直接相關(guān),能刺激機(jī)體產(chǎn)生CELL 免疫和體液免疫反應(yīng);③保護(hù)RABV 在復(fù)制過程中免遭破壞;④病毒RNA 從轉(zhuǎn)錄向復(fù)制切換起到重要作用;⑤調(diào)節(jié)病毒的轉(zhuǎn)錄與復(fù)制的過程。因此,開展N 基因序列檢測對篩選RABV 疫苗毒株具有重大意義。近年來狂犬病病例雖然在全國有所下降,但仍然是傳染病重點(diǎn)防控對象,廣西屬狂犬病主要疫區(qū),百色市是重災(zāi)區(qū)。RABV 主要侵害動物和人的神經(jīng)系統(tǒng),95%的病例是被帶毒動物咬傷感染的[2],因此,對動物狂犬病開展高密度免疫是防控狂犬病主要手段,選擇動物狂犬病疫苗毒株顯得尤為重要。為做好疫苗毒株選擇,本試驗(yàn)通過分析百色市RABV 流行野毒株與疫苗株N 基因間的差異,最終選定疫苗毒株,為百色市狂犬病防控打基礎(chǔ)。
2009-2012 年從百色市12 個(gè)縣(市、區(qū))臨床健康犬腦組織標(biāo)本470 份,寵物門診和農(nóng)戶散養(yǎng)犬唾液178 份,-20℃凍存送檢。
1)分離、鑒定及PCR 產(chǎn)物回收鑒定等由廣西壯族自治區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室操作完成。
2)RABV N 基因序列分析提取PCR 產(chǎn)物送上海生物公司進(jìn)行序列測定。
本次測序共獲得RABV4 株野毒N 基因序列,分別編號為:1號、2 號、3 號、4 號,病毒N 基因核苷酸全長1425bp,測出開放閱讀框?yàn)?353bp,推導(dǎo)氨基酸編碼450 個(gè)。
Kissi 等[3]提出RABV 分型標(biāo)準(zhǔn),野毒株N 基因核苷酸和氨基酸序列同源性為88.9%~99.3%和98.4%~99.1%,為基因I 型;1 號與2 號、3 號、4 號菌株核苷酸和氨基酸同源性分別為99.3%和99.3%、88.9%和89.2%、88.9%和89.2%。按照核苷酸和氨基酸同源性分析可分成兩個(gè)亞群,1 號、2 號菌株為一個(gè)亞群,3 號、4 號菌株為另一個(gè)亞群。N 基因野毒株與CTN-1 株、Flur-HEP 株、CVS-11株和ERA 株核苷酸同源性比對驗(yàn)證結(jié)果分別為:89.7%~95.5%、87.4%~88.3%、87.4%~87.9%和87.6%~88.5%;氨基酸同源性比對驗(yàn)證結(jié)果分別為:98.4%~99.1%、98.2%~98.6%、97.3%~98.9%和97.1%~97.3%。野毒株與CTN-1 株核苷酸、氨基酸同源性最高,見表1。
表1 RABV野毒株與疫苗株N基因核苷酸、氨基酸同源性比較
磷酸化位點(diǎn)389、375 位與疫苗株保持高度一致。1~4 號野毒株S389 高度保持穩(wěn)定,T375 與疫苗株保持高度一致[4]。
將已知N 基因5 個(gè)功能區(qū)182 個(gè)氨基酸序列野毒株與疫苗株差異比對。野毒株與CTN-1、Flur-HEP、CVS-11、ERA 株差異百分比分別為:0.67%~1.11%、0.89%~1.11%、1.11%~2.44%、1.56%~2.22%,野毒株與CTN-1 差異最小,F(xiàn)lur-HEP 株次之,ERA 株差異最大,見表2。
1)維持N 蛋白構(gòu)型有關(guān)的功能區(qū)氨基酸序列抗原位點(diǎn)進(jìn)行比對。疫苗株與野毒株功能區(qū)35 個(gè)氨基酸序列進(jìn)行比對,野毒株與CTN-1、Flur-HEP、CVS-11、ERA株差異百分比分別為:17.1%、17.1%、22.9%、25.7%,野毒株與CTN-1 株、Flur-HEP 株差異最小,ERA 株差異最大[5]。
表2 野毒株與疫苗株功能區(qū)氨基酸序列差異百分比(%)
2)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫反應(yīng)的功能區(qū)氨基酸序列抗原位點(diǎn)進(jìn)行比對。將功能區(qū)58 個(gè)氨基酸序列疫苗株與野毒比對,野毒株與CTN-1、Flur-HEP、CVS-11、ERA 株差異百分比分別為:12.1%、12.1%、15.5%、24.1%,野毒株與CTN-1 差異最小,ERA 株差異最大[6,7]。
3)激活體內(nèi)外Th 細(xì)胞的功能區(qū)氨基酸序列抗原位點(diǎn)進(jìn)行比對。激活Th 細(xì)胞產(chǎn)生免疫因子相關(guān)功能區(qū)41 個(gè)氨基酸序列比對,野毒株與CTN-1、Flur-HEP、CVS-11、ERA 株差異百分比分別為:5%、5%、5%、15%,野毒株與CTN-1 株、Flur-HEP 株、CVS-11 株差異最小,ERA 株差異最大[8,9]。
4)促進(jìn)機(jī)體的體液免疫功能區(qū)氨基酸序列抗原位點(diǎn),共30 個(gè)氨基酸序列進(jìn)行比對,野毒株與CTN-1、Flur-HEP、CVS-11、ERA 株差異百分比分別為:0.0%、13.3%、26.6%、13.3%,野毒株與CTN-1株無差異,CVS-11 株差異最大[10]。
綜合上述結(jié)果,表明百色市目前流行RABV 為基因I 型,可分成2 個(gè)亞型毒株,經(jīng)核苷酸、氨基酸、功能區(qū)氨基酸序列和免疫機(jī)能有關(guān)的功能區(qū)氨基酸序列比對,野毒株與CIN-1 株核苷酸、氨基酸同源性最高,親緣性最近,N 基因功能區(qū)及免疫機(jī)能有關(guān)功能區(qū)氨基酸序列差異最小,F(xiàn)lury-HEP 株次之,CIN-1 株應(yīng)是百色地區(qū)防控狂犬病首選疫苗毒株。