潘懿，霍秀龍，韋顯凱

（1.百色市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局廣西百色 533300；2.平果縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心廣西百色 531400；3.廣西壯族自治區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心南寧 530001）

RABV（狂犬病毒）蛋白質(zhì)占74%，其中N 蛋白占36%[1]，N 蛋白具有五個(gè)方面特性：①變異幾率較底，穩(wěn)定性高；②與病毒免疫直接相關(guān)，能刺激機(jī)體產(chǎn)生CELL 免疫和體液免疫反應(yīng)；③保護(hù)RABV 在復(fù)制過程中免遭破壞；④病毒RNA 從轉(zhuǎn)錄向復(fù)制切換起到重要作用；⑤調(diào)節(jié)病毒的轉(zhuǎn)錄與復(fù)制的過程。因此，開展N 基因序列檢測(cè)對(duì)篩選RABV 疫苗毒株具有重大意義。近年來狂犬病病例雖然在全國有所下降，但仍然是傳染病重點(diǎn)防控對(duì)象，廣西屬狂犬病主要疫區(qū)，百色市是重災(zāi)區(qū)。RABV 主要侵害動(dòng)物和人的神經(jīng)系統(tǒng)，95%的病例是被帶毒動(dòng)物咬傷感染的[2]，因此，對(duì)動(dòng)物狂犬病開展高密度免疫是防控狂犬病主要手段，選擇動(dòng)物狂犬病疫苗毒株顯得尤為重要。為做好疫苗毒株選擇，本試驗(yàn)通過分析百色市RABV 流行野毒株與疫苗株N 基因間的差異，最終選定疫苗毒株，為百色市狂犬病防控打基礎(chǔ)。

1 檢測(cè)樣品來源

2009-2012 年從百色市12 個(gè)縣（市、區(qū)）臨床健康犬腦組織標(biāo)本470 份，寵物門診和農(nóng)戶散養(yǎng)犬唾液178 份，-20℃凍存送檢。

2 RABV 分離、鑒定和基因序列測(cè)定

1）分離、鑒定及PCR 產(chǎn)物回收鑒定等由廣西壯族自治區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室操作完成。

2）RABV N 基因序列分析提取PCR 產(chǎn)物送上海生物公司進(jìn)行序列測(cè)定。

3 RABV N 基因序列、功能區(qū)氨基酸序列比對(duì)

本次測(cè)序共獲得RABV4 株野毒N 基因序列，分別編號(hào)為：1號(hào)、2 號(hào)、3 號(hào)、4 號(hào)，病毒N 基因核苷酸全長1425bp，測(cè)出開放閱讀框?yàn)?353bp，推導(dǎo)氨基酸編碼450 個(gè)。

3.1 RABV 野毒株與疫苗株N 基因核苷酸、氨基酸同源性比對(duì)

Kissi 等[3]提出RABV 分型標(biāo)準(zhǔn)，野毒株N 基因核苷酸和氨基酸序列同源性為88.9%～99.3%和98.4%～99.1%，為基因I 型；1 號(hào)與2 號(hào)、3 號(hào)、4 號(hào)菌株核苷酸和氨基酸同源性分別為99.3%和99.3%、88.9%和89.2%、88.9%和89.2%。按照核苷酸和氨基酸同源性分析可分成兩個(gè)亞群，1 號(hào)、2 號(hào)菌株為一個(gè)亞群，3 號(hào)、4 號(hào)菌株為另一個(gè)亞群。N 基因野毒株與CTN-1 株、Flur-HEP 株、CVS-11株和ERA 株核苷酸同源性比對(duì)驗(yàn)證結(jié)果分別為：89.7%～95.5%、87.4%～88.3%、87.4%～87.9%和87.6%～88.5%；氨基酸同源性比對(duì)驗(yàn)證結(jié)果分別為：98.4%～99.1%、98.2%～98.6%、97.3%～98.9%和97.1%～97.3%。野毒株與CTN-1 株核苷酸、氨基酸同源性最高，見表1。

3.2 磷酸化位點(diǎn)389、375 位點(diǎn)比對(duì)

表1 RABV野毒株與疫苗株N基因核苷酸、氨基酸同源性比較

磷酸化位點(diǎn)389、375 位與疫苗株保持高度一致。1～4 號(hào)野毒株S389 高度保持穩(wěn)定，T375 與疫苗株保持高度一致[4]。

3.3 N 基因的各個(gè)功能區(qū)氨基酸序列比對(duì)

將已知N 基因5 個(gè)功能區(qū)182 個(gè)氨基酸序列野毒株與疫苗株差異比對(duì)。野毒株與CTN-1、Flur-HEP、CVS-11、ERA 株差異百分比分別為：0.67%～1.11%、0.89%～1.11%、1.11%～2.44%、1.56%～2.22%，野毒株與CTN-1 差異最小，F(xiàn)lur-HEP 株次之，ERA 株差異最大，見表2。

1）維持N 蛋白構(gòu)型有關(guān)的功能區(qū)氨基酸序列抗原位點(diǎn)進(jìn)行比對(duì)。疫苗株與野毒株功能區(qū)35 個(gè)氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，野毒株與CTN-1、Flur-HEP、CVS-11、ERA株差異百分比分別為：17.1%、17.1%、22.9%、25.7%，野毒株與CTN-1 株、Flur-HEP 株差異最小，ERA 株差異最大[5]。

表2 野毒株與疫苗株功能區(qū)氨基酸序列差異百分比（%）

2）誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫反應(yīng)的功能區(qū)氨基酸序列抗原位點(diǎn)進(jìn)行比對(duì)。將功能區(qū)58 個(gè)氨基酸序列疫苗株與野毒比對(duì)，野毒株與CTN-1、Flur-HEP、CVS-11、ERA 株差異百分比分別為：12.1%、12.1%、15.5%、24.1%，野毒株與CTN-1 差異最小，ERA 株差異最大[6,7]。

3）激活體內(nèi)外Th 細(xì)胞的功能區(qū)氨基酸序列抗原位點(diǎn)進(jìn)行比對(duì)。激活Th 細(xì)胞產(chǎn)生免疫因子相關(guān)功能區(qū)41 個(gè)氨基酸序列比對(duì)，野毒株與CTN-1、Flur-HEP、CVS-11、ERA 株差異百分比分別為：5%、5%、5%、15%，野毒株與CTN-1 株、Flur-HEP 株、CVS-11 株差異最小，ERA 株差異最大[8,9]。

4）促進(jìn)機(jī)體的體液免疫功能區(qū)氨基酸序列抗原位點(diǎn)，共30 個(gè)氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，野毒株與CTN-1、Flur-HEP、CVS-11、ERA 株差異百分比分別為：0.0%、13.3%、26.6%、13.3%，野毒株與CTN-1株無差異，CVS-11 株差異最大[10]。

4 結(jié)論

綜合上述結(jié)果，表明百色市目前流行RABV 為基因I 型，可分成2 個(gè)亞型毒株，經(jīng)核苷酸、氨基酸、功能區(qū)氨基酸序列和免疫機(jī)能有關(guān)的功能區(qū)氨基酸序列比對(duì)，野毒株與CIN-1 株核苷酸、氨基酸同源性最高，親緣性最近，N 基因功能區(qū)及免疫機(jī)能有關(guān)功能區(qū)氨基酸序列差異最小，F(xiàn)lury-HEP 株次之，CIN-1 株應(yīng)是百色地區(qū)防控狂犬病首選疫苗毒株。