孫麗慧 李倩 蔣榮響 林鋒

摘要：從患病擬穴青蟹（Scylla paramamosain）肝胰腺中分離到2種優(yōu)勢菌株，對2種優(yōu)勢菌株進行了鑒定和特性分析。利用形態(tài)學觀察、生理生化特性分析和16S rDNA序列測定法對細菌類別進行判定，并采用藥敏試驗對細菌的耐藥性進行分析。結果表明，這2種細菌分別為弧菌（Vibrio sp.）和希瓦氏菌（Shewanella），利用15種抗生素對2種細菌進行藥敏試驗分析，發(fā)現(xiàn)2種細菌對恩諾沙星、氟苯尼考、強力霉素高度敏感，對其他幾種抗生素則有一定的耐受性。研究進一步證實了海水致病性弧菌是擬穴青蟹細菌性疾病高發(fā)的主要原因，也表明希瓦氏菌可能是一種潛在病原菌，與弧菌協(xié)同作用，對擬穴青蟹規(guī)模化養(yǎng)殖造成危害，同時也為擬穴青蟹養(yǎng)殖過程中細菌性病害的確定和防治提供參考依據(jù)。

關鍵詞：擬穴青蟹（Scylla paramamosain）;弧菌（Vibrio sp.）;希瓦氏菌（Shewanella）;16S rDNA;藥敏試驗

中圖分類號：S943? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）02-0096-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.02.021? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

擬穴青蟹（Scylla paramamosain）俗稱青蟹，具有生長快、肉質鮮美、營養(yǎng)價值高等優(yōu)點，是中國東南沿海重要的經(jīng)濟蟹類之一[1]。近年來，青蟹養(yǎng)殖規(guī)模的逐步擴大，但由于養(yǎng)殖配合飼料相對滯后，冰鮮餌料極易導致水質惡化，從而導致青蟹病害日趨嚴重[2，3]。目前，青蟹常見病害主要有病毒病、細菌病和寄生蟲病[4]。其中，已報道的細菌病主要致病菌有非液化摩拉氏菌[5]、辛辛那提弧菌[6]、溶藻弧菌[6]、副溶血性弧菌[6]、嗜水氣單胞菌[7]、溫和氣單胞菌等[8]。由于細菌的復雜性、多樣性，在一定條件下給青蟹養(yǎng)殖業(yè)造成極大損失。然而中國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)種類繁多，水生生物學基礎研究相對滯后，導致許多病因無法判定，故無法采用有效措施進行防治?；【╒ibrio sp.）是菌體短小，彎曲成弧形，尾部帶一鞭毛的革蘭氏陰性菌，廣泛分布于河口、海灣、近岸海域的海水和海洋動物體內。其致病性受宿主的生理狀態(tài)及水質環(huán)境條件等綜合因素的影響較大，是一類條件致病菌。近年來，由于養(yǎng)殖水域生態(tài)變化，弧菌已成為海水養(yǎng)殖動物的主要病原菌之一。目前，作為海水養(yǎng)殖動物弧菌病原菌已有較多報道[9-19]。希瓦氏菌屬（Shewanella）為革蘭氏陰性桿菌，兼性厭氧，具單一極生鞭毛，DNA的G+C含量為43%～55%。腐敗希瓦氏菌和海藻希瓦氏菌是人類和其他生物的潛在病原菌，國內外相繼報道了有關希瓦氏菌感染海水養(yǎng)殖動物的研究[20-24]。隨著研究深入，淡水養(yǎng)殖動物感染希瓦氏菌的病例也陸續(xù)有了相關報道[25-27]。這說明該菌所具有的潛在致病性對水產(chǎn)養(yǎng)殖形成嚴重威脅，所以必須對該病原菌給予足夠的重視。因此，本研究通過對患病青蟹體內病原菌分離、16S rDNA序列分析鑒定病原菌的類別，并利用藥敏試驗來初步篩選治療該病的藥物，開展典型性青蟹病癥的研究，有利于針對不同的病癥采取有效的治療措施，降低經(jīng)濟損失。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 樣品來源? 2017年6月取自浙江省三門縣綠洋特種水產(chǎn)養(yǎng)殖專業(yè)合作社，送檢樣品除1只存活外均已死亡，外部觀察無明顯病癥。解剖結果，肉體略發(fā)紅，鰓明顯發(fā)黑，已死亡青蟹肝胰腺有明顯性腫大。

1.1.2? 培養(yǎng)基及試劑? 營養(yǎng)肉湯干粉、瓊脂干粉、細菌理化特征性鑒定用的培養(yǎng)基和藥敏試紙購自杭州天和微生物試劑有限公司;革蘭氏染色液購自南京建成生物工程研究所;PCR擴增試劑購自寶生物工程（大連）有限公司;PCR引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.2? 方法

1.2.1? 細菌分離? 在無菌條件下，用酒精棉球擦拭患病青蟹體表后進行解剖，取血、心、肝胰臟和腸等組織樣品，分別在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)平板（pH 7.4）上劃線培養(yǎng)，28 ℃培養(yǎng)12 h，根據(jù)菌落特征，挑取單菌落劃線分離。

1.2.2? 細菌形態(tài)觀察? 將分離菌接種于培養(yǎng)基平板上，置于28 ℃培養(yǎng)12 h，取菌體涂片，革蘭氏染色后用光學顯微鏡觀察菌體形態(tài)和染色特征。

1.2.3? 16S rDNA序列測定和系統(tǒng)發(fā)育學分析? 16S rDNA基因序列的擴增采用細菌通用引物，正向引物為27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物1492R：5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′。擴增片段大小為1 470 bp。PCR擴增反應體系：10×Buffer 5.0 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4.0 μL、10 μmol/L引物各1 μL，5 U/μL Taq酶0.5 μL、模板菌液3 μL，ddH2O補足至50 μL。PCR擴增反應程序：95 ℃預變性4 min;94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并將陽性克隆送至上海生工生物工程技術服務有限公司進行核苷酸序列測定。根據(jù)分離菌的核苷酸測序結果，利用NCBI的Blast檢索系統(tǒng)（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast/）進行序列同源性比較，采用MEGA6軟件構建系統(tǒng)發(fā)生樹，采用鄰接法（Neighbor joining method）構建系統(tǒng)發(fā)育樹方法，并通過Boot-strap法檢驗。

1.2.4? 藥敏試驗? 藥物敏感性試驗按紙片擴散法[28]進行，測定抑菌圈直徑，并參照NCCLS判斷標準[29]進行敏感性判定。檢測的抗生素包括慶大霉素、氟苯尼考、萬古霉素、卡那霉素、恩諾沙星、強力霉素、鏈霉素、新霉素、多粘菌素B、拉氧頭孢、阿米卡星、復方新諾明、妥布霉素、呋喃唑酮和頭孢唑啉等15種。

1.2.5? 致病性試驗? 將分離菌以3 000 r/min離心收集沉淀，用已經(jīng)滅菌的0.85%生理鹽水，吹打懸浮制成細菌懸液。選取規(guī)格相近（150 g）的擬穴青蟹40只，每10只為1組，3組為試驗組，1組為對照組。分別給每只青蟹注射0.1 mL細菌懸液（濃度約為1×109 CFU/mL）;對照組每只僅注射0.1 mL無菌生理鹽水，相同環(huán)境下分別隔離飼養(yǎng)，統(tǒng)計發(fā)病率和死亡率。

2? 結果與分析

2.1? 細菌的形態(tài)特征

從患病青蟹肝胰臟組織中分離到2種優(yōu)勢菌，分別標記為QX170601和QX170602。其中，細菌QX170601菌體短小、彎曲成弧形或直桿狀，具有一端單一鞭毛，初步判定為革蘭氏陰性菌;細菌QX170602菌體短桿狀，彎曲，菌落酪黃色，較小，光滑，邊緣規(guī)整，略凸起，初步判定為革蘭氏陰性菌。

2.2? 細菌16S rDNA序列鑒定

利用16S rDNA通用引物進行PCR擴增，獲得了菌株的核苷酸序列。將核苷酸測序結果通過Blast比對，發(fā)現(xiàn)菌株QX170601和QX170602與弧菌和希瓦氏菌同源性高達99%，選擇同源性較高的16S rDNA序列構建系統(tǒng)發(fā)育學樹，再結合QX170601和QX170602的菌落形態(tài)、革蘭氏染色情況可以基本判定QX170601為弧菌屬，而QX170602與希瓦氏菌為同一屬的細菌。

2.3? 藥敏試驗

選取常用的15種抗生素藥敏紙片，對弧菌和希瓦氏菌進行藥敏試驗。結果表明，QX170601和QX170602同時對氟苯尼考、恩諾沙星、強力霉素高敏，對慶大霉素、卡那霉素、呋喃唑酮、頭孢唑啉、多粘菌素B、復方新諾明中度敏感，此外QX170602還對拉氧頭孢、阿米卡星、妥布霉素中度敏感，對其他抗生素有一定耐藥性（表1）。

2.4? 細菌致病性試驗

青蟹分別接種細菌QX170601、QX170602以及QX170601與QX170602的混合懸液。1 d后觀察發(fā)現(xiàn)注射菌液的3組青蟹均出現(xiàn)活力下降癥狀，第4天后，注射JS1501-JS1502混合菌液組青蟹開始出現(xiàn)死亡，直至第7天全部死亡;而第7天注射QX170601的死亡率約為60%;QX170602組死亡率僅為20%，而對照組一直沒有出現(xiàn)死亡。結果表明，分離菌QX170601具有明顯致死率，在與QX170602的協(xié)同作用下毒力更強（表2）。

3? 小結與討論

在青蟹病原菌的診斷過程中，采用了目前正逐步廣泛用于養(yǎng)殖環(huán)境微生物群落的分析和病原菌鑒定的16S rDNA通用引物PCR擴增法[30，31]，再結合經(jīng)典的革蘭氏染色法、負染電鏡觀察法，通過細菌形態(tài)觀察和核酸鑒定，對從患病青蟹分離到的2種菌株進行快速、準確地判定，藥敏試驗結果表明，這兩種菌具有較強的耐藥性。

近年來，隨著青蟹養(yǎng)殖規(guī)模的擴大，青蟹病害日趨嚴重。到目前為止，研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)弧菌和希瓦氏菌屬于條件性致病菌，如青蟹配合飼料缺乏，冰鮮魚投喂，導致養(yǎng)殖環(huán)境不佳時可誘發(fā)青蟹感染，從而導致青蟹體色發(fā)白，活動能力明顯減弱，攝食量減少或不攝食。針對目前青蟹養(yǎng)殖種的病害現(xiàn)狀，一方面要注重前期重大病原檢測，如苗種引進時可進行規(guī)范性檢測，降低和杜絕病原的攜帶，從源頭上進行防范;另一方面，針對條件性致病菌，要防止養(yǎng)殖水環(huán)境惡化，降低條件性致病菌的暴發(fā)率，并對高致死率的病原菌進行綜合防治，長期、連續(xù)抽樣監(jiān)測，進行防控，也要制備相應的疫苗和有效的藥物進行細菌病的阻斷遏制。

本研究目的在于對致死率較高、暴發(fā)面較廣的青蟹病原菌進行確診鑒定，對其生物學特性進行初步研究，為致病菌的防控提供基礎研究數(shù)據(jù)，便于病害防控數(shù)據(jù)庫的建立。

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