丁學(xué)利

( 寧夏葡萄酒與防沙治沙職業(yè)技術(shù)學(xué)院，銀川 750199)

枸杞子通常是人們對茄科枸杞屬多年生落葉灌木—寧夏枸杞(Lyciumbarbaruv)果實的統(tǒng)稱，其富含枸杞多糖、類胡蘿卜素、甜菜堿、黃酮、多種維生素等多種營養(yǎng)成分和生物活性物質(zhì)[1]，具有多方藥理作用和生物活性功能[2]，如抗病毒、抗凝血、抗腫瘤、降低血糖、保護腎臟等[3-4]。枸杞發(fā)酵酒是以寧夏枸杞干果為原料，在控溫條件下通過酵母菌發(fā)酵制成，可以較大程度保持枸杞原料的風味和生物活性成分，使營養(yǎng)成分更易于吸收，而且產(chǎn)品風味獨特、多樣，酒度較低，受眾更廣，更符合國內(nèi)外飲料向天然、健康、保健發(fā)展的趨勢，具有很大的發(fā)展空間和市場潛力，是枸杞深加工的趨勢之一[5-8]。

枸杞中的主要含氮化合物為氨基酸，游離氨基酸的含量對所發(fā)酵的枸杞酒有重要的影響，將直接影響枸杞酒的酒精發(fā)酵[9]。研究表明，若發(fā)酵液中氮源缺乏或比例不合適，會對釀酒產(chǎn)生不良的影響，嚴重時會引起發(fā)酵停滯，并會產(chǎn)生過多的硫化氧、雙乙酰，影響酒的香氣物質(zhì)形成，產(chǎn)生過多的高級醇，最終影響酒的品質(zhì)[10]。近年來，人們對枸杞酒制作的工藝方法研究較多[11-15]，而對發(fā)酵過程中氨基酸的變化研究很少。因此，為進一步改善枸杞干果酒制作工藝、提高酒品質(zhì)量，我們以不同發(fā)酵階段枸杞酒為材料，分析了其在酒精發(fā)酵過程中氨基酸組成及其含量的變化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

以干枸杞為材料，在10 t不銹鋼發(fā)酵罐中進行發(fā)酵[16]，在原料添加的時候同時加入水、果膠酶和偏重亞硫酸鉀，控溫浸漬，然后調(diào)整成分，接種酵母，控溫發(fā)酵。在這一過程中，按照比重變化，每隔24 h取一次樣，樣品編號依次為D1-D7，并以樣品編號代表發(fā)酵過程中的不同時間。

氯化銨、濃鹽酸、冰醋酸、硼酸、四硼酸鈉均為分析純，購自北京化工廠(Beijing,China)；三水合乙酸鈉為分析純，購自西隴化工廠(Guangdong,China)；乙氧基亞甲基丙二酸二乙酯(DEEMM)、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、絲氨酸、谷氨酰胺、組氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、β-丙氨酸、精氨酸、α-丙氨酸、GABA、脯氨酸、酪氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、異亮氨酸、色氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和賴氨酸均為色譜純，購自Sigma(St. Louis,USA)；色譜純乙腈和甲醇購自Fisher(Hampton, USA)，疊氮化鈉購自生工(Shanghai, China)；超純水取自Milli-Q 純化系統(tǒng)。

高效液相色譜儀(SPD-M20A，日本島津有限公司)，數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司)，KQ3200DE 型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，F(xiàn)A204 電子分析天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)，50 μl 微量進樣器(上海高鴿工貿(mào)有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 酒樣衍生化反應(yīng) 枸杞酒中氨基酸含量用液相色譜法測定。將 875 μl的硼酸緩沖液(1 mol·L-1，pH=9)、37 μl甲醇、25 μl樣品、485 μl純水和15 μl乙氧基亞甲基丙二酸二乙酯( DEEMM )置于2 ml離心管中混合均勻。將樣品放入水浴中，超聲35 min。后將樣品置于70 ℃水浴內(nèi)加熱2 h，0.45 μm 的有機系濾膜過濾備用。

1.2.2 液相條件 色譜柱為Venusil XBP C18液相色譜柱 (4.6 mm×250 mm×5 m，Agela Technologies, 天津)。

流動相成分：有機相為乙腈與甲醇按4∶1 的比例混合；水相為帶有0.02%疊氮化鈉的25 mM、pH=5.8的醋酸緩沖液。流動相的流速為每分鐘0.9 ml，檢測波長280 nm，溫度為室溫，進樣體積為20 μl，進樣之前用0.45 μm 的有機系濾膜過濾。采用二元高壓梯度洗脫，洗脫程序見表，通過比較相應(yīng)標準品的保留時間和標準曲線確定氨基酸含量[17]。

表1 梯度洗脫條件

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2016進行標準曲線、相關(guān)系數(shù)和線性方程計算或模擬，利用SPSS v19 statistical software(SPSS Inc., Chicago, IL, USA) 進行顯著性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 枸杞酒主要氨基酸種類、含量和所占比例的變化

通過對不同發(fā)酵階段枸杞酒的測定，一共檢測出20種氨基酸，其中含有一種天然存在的非蛋白質(zhì)氨基酸GABA，必須氨基酸8種，種類較為豐富。不同發(fā)酵階段枸杞酒的游離氨基酸總含量為1 975.71～5 660.85 mg·L-1，發(fā)酵結(jié)束后的總游離氨基酸含量為1 975.71 mg·L-1。與李沁婭等[18]測定的11種保健酒游離氨基酸種類25種、必須氨基酸種類6種、總游離氨基酸含量32.17～1 799.14 mg·L-1，唐柯等[19]測定的47款中國產(chǎn)地葡萄酒游離氨基酸種類17種、氨基酸含量447.13～1 359.06 mg·L-1，沈穎等[20]測定的不同發(fā)酵溫度下的荔枝酒含有14種氨基酸、含量為341.049～412.161 mg·L-1等相比，枸杞酒氨基酸種類豐富、含量高。同時與發(fā)酵前相比，枸杞酒發(fā)酵后氨基酸含量明顯下降，表明在發(fā)酵過程中，微生物消耗了部分氨基酸[21]。在接種酵母之前，多數(shù)氨基酸的含量在逐漸升高，這可能與浸漬時間及添加果膠酶類直接有關(guān)，隨著果膠酶對果膠類物質(zhì)的分解和浸漬時間的延長，枸杞中的氨基酸逐漸浸出，含量增加。在接種酵母之前，其中脯氨酸、谷氨酰胺等8種氨基酸構(gòu)成了氨基酸的主體，占比相對較大，其含量占氨基酸總量的94.6%；發(fā)酵結(jié)束后，在多數(shù)氨基酸含量不同程度下降的同時，這8種含量占氨基酸總含量的份額也下降至90.3%，氨基酸總量中脯氨酸、谷氨酰胺等7種氨基酸構(gòu)成了氨基酸的主體，且這7種氨基酸含量在發(fā)酵前后變化幅度較小，而天冬氨酸含量占比由發(fā)酵前3.8%下降為發(fā)酵后1.5%，這可能與AlbertG等[22]認為的酵母菌可以利用天冬氨酸經(jīng)過某種途徑生成蘇氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸有關(guān)。

表2 干果枸杞酒發(fā)酵前后主要氨基酸所占比

2.2 發(fā)酵過程中各種氨基酸含量的變化

測定發(fā)現(xiàn)在浸漬和發(fā)酵過程中，氨基酸的含量均為先上升后下降，這可能與浸漬和發(fā)酵速度有關(guān)系。剛接種酵母，酵母的濃度比較低，利用的氨基酸較少，而隨浸漬時間的不斷延長，氨基酸浸出越來越多，含量上升，之后隨酵母活性的逐漸增強，氨基酸消耗增大，含量下降劇烈，最后達到最低值。其中，有16種氨基酸的最終濃度低于初始濃度。

圖1 色氨酸、異亮氨酸、甘氨酸和酪氨酸在發(fā)酵過程中濃度的變化

由圖1可以看出，色氨酸、異亮氨酸、甘氨酸、酪氨酸等4種氨基酸的初始含量均比較低，分別占初始含氨基酸總量的0.16%～0.29%，在發(fā)酵過程中，色氨酸和異亮氨酸的變化趨勢比較類似即前期平緩上升，第四天達高峰，之后降幅較大；甘氨酸由第一天下降到第二天的低谷后一直上升，至第六天達到最高峰，之后再又大幅下降至最低值，發(fā)酵過程中的含量變化總體比較劇烈。這4種氨基酸中，色氨酸的消耗比例最大，最后含量僅為初始的22.6%，而且實際減少量也是這4種氨基酸中最大的，降低了6.86 mg·L-1。

圖2顯示，GABA、亮氨酸、谷氨酸、天冬氨酸等4種氨基酸含量為 36.11～127.32 mg·L-1，高于前面4種氨基酸，它們分別占初始總含量0.78%～2.95%，其中天冬氨酸初始含量較高，在發(fā)酵過程中，被大量的消耗，降低99.11 mg·L-1，最終含量僅為最后初始含量23.4%, GABA、亮氨酸、谷氨酸等3種氨基酸的變化趨勢比較類似，在發(fā)酵過程中含量變化相對不大，約消耗了初始的一半以上，這4種氨基酸的最終濃度較為接近，介于14.01～48.34 mg·L-1。

圖2 GABA、亮氨酸、谷氨酸和天冬氨酸在發(fā)酵過程中濃度變化

如圖3所示，纈氨酸、蘇氨酸、α-丙氨酸、絲氨酸等4種氨基酸的變化趨勢較為類似，即前期比較平穩(wěn)，中期降幅較大尤其是α-丙氨酸、絲氨酸，后期又比較平穩(wěn)；結(jié)合比重分析，這4種氨基酸含量劇烈下降的中期(D4-D6)，也是發(fā)酵最為劇烈的時期，酵母的活動最旺盛，特別是對α-丙氨酸的利用量最大，消耗了初始含量的82%，在D5-D7期間，消耗量占整個過程消耗量99%，完全和發(fā)酵過程對應(yīng)。為此，可以通過監(jiān)測α-丙氨酸的變化來間接的監(jiān)控發(fā)酵的過程。

圖3 纈氨酸、蘇氨酸、α-丙氨酸和絲氨酸在發(fā)酵過程中濃度變化

由圖4所知，精氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、脯氨酸等4種氨基酸初始濃度較高，發(fā)酵結(jié)束后濃度下降幅度相對不大，特別是脯氨酸發(fā)酵結(jié)束后含量依然占總含量的33.3%，且與其它3種不同，在發(fā)酵變化過程中的D6-D7時間下降最為劇烈，而在之前的過程中含量一直上升，其它3種氨基酸濃度都是前期一直上升或波浪式上升，至D4達最高峰，之后隨著發(fā)酵的逐漸旺盛一直下降，最終分別達到低于各自的初始濃度。

圖4 精氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和脯氨酸在發(fā)酵過程中的濃度變化

從表3可以看出，在枸杞干果酒發(fā)酵過程中組氨酸和半胱氨酸含量雖有變化但差異不顯著，表明這2種氨基酸幾乎沒參與和影響總氨基酸含量的變化，這可能和發(fā)酵的酵母有關(guān)，它們沒有利用這2種氨基酸。甲硫氨酸含量隨發(fā)酵時間延長先升高之后又降低，但最終含量為10.81 mg·L-1，比初始含量8.53 mg·L-1增加了26.7%，這可能因酵母的發(fā)酵作用，將其他物質(zhì)代謝后為甲硫氨酸。

表3 枸杞干果酒發(fā)酵過程中的氨基酸含量 單位：mg·L-1

3 結(jié)論

高效液相色譜分析發(fā)現(xiàn)，枸杞干果酒發(fā)酵過程中，含有 谷氨酰胺、脯氨酸、天冬酰胺 等20種氨基酸，其中有8種必須氨基酸；發(fā)酵前游離氨基酸總量為4 379.61 mg·L-1，發(fā)酵結(jié)束后游離氨基酸總量為1 975.71 mg·L-1，發(fā)酵前各種游離氨基酸含量為6.65～1 325.61 mg·L-1，發(fā)酵結(jié)束后各種游離氨基酸含量為2.45～668.75 mg·L-1；發(fā)酵后16種氨基酸的含量分別下降，其余4種的含量分別上升或不變；發(fā)酵過程中的氨基酸含量變化趨勢基本是先上升，后下降，最后達到最低值；與其他酒類相比，枸杞干果酒氨基酸種類豐富、含量較高。本實驗僅對發(fā)酵過程中的氨基酸含量進行了測定研究，而未對參與代謝、合成過程的氨基酸種類進行研究，亦即沒有最終確定酵母在酒精發(fā)酵中最需要的氨基酸種類，這也是我們今后研究的一個方向。