楊 恒，盛 偉，張新笑，李鵬鵬，王道營，鄒 燁，徐為民

（1.南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇南京 210023；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇南京 210014）

動(dòng)物血漿年產(chǎn)量大，營養(yǎng)豐富，血漿中含有纖維蛋白、白蛋白、球蛋白以及其他少量脂蛋白、糖蛋白等［1-3］，而血漿中的蛋白質(zhì)總稱為血漿蛋白［4］。血漿蛋白中含有人體所需的18種氨基酸，其中包括8種必需氨基酸，其中賴氨酸（Lys）可達(dá)6.50%以上［5］，血漿蛋白中含有豐富的礦物質(zhì)，磷含量約占血漿蛋白粉總量的1.78%，鈣含量達(dá)到0.20%，鐵含量達(dá)到78 mg/kg［6］，另外，血漿蛋白中還含有較多的促生長因子、干擾素、激素、溶菌酶等其他功能成分［7］。

我國每年的肉雞屠宰量達(dá)10億多羽，雞血來源豐富。雞血中含大量蛋白質(zhì)、氨基酸、微量元素、維生素、酶類和其他生物活性物質(zhì)，而脂肪和糖類含量較低，其中含干物質(zhì)17.90%、礦物質(zhì)5.90%（大部分為鐵）、必要元素2.30%、磷0.56%［8-9］，而雞血細(xì)胞中必需氨基酸含量在畜禽動(dòng)物中最高，但目前對雞血的研究較少，而且大量的雞血作為廢棄物排放，造成資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。

本研究旨在通過測定不同超聲處理時(shí)間下雞血漿蛋白的多種理化特性，全面分析超聲作用對血漿蛋白性質(zhì)和結(jié)構(gòu)的影響，為血漿蛋白的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)，使其在醫(yī)藥工業(yè)、食品工業(yè)和飼料工業(yè)等方面有更廣闊的前景。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 材料 雞血漿蛋白凍干品：實(shí)驗(yàn)室自制。主要操作：取少量檸檬酸三鈉飽和溶液加入現(xiàn)取雞血血漿并攪拌均勻，后采用60 mL離心管分裝，以3 000～3 500 r/min離心15 min，取上清液裝入表面皿，用保鮮膜、橡皮筋封存，放入-40℃冰箱保藏。待樣品完全凍結(jié)后放入凍干機(jī)42～45 h后取出即得到試驗(yàn)用血漿蛋白粉。

1.1.2 主要試劑 1-苯氨基-8萘橫酸鹽（ANS）、β-巰基乙醇（購自美國Sigma公司）；Marker（購自上海源葉生物科技有限公司）；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉（購自西隴化工股份有限公司）；考馬斯亮藍(lán)（購自南京建成生物科技有限公司）；Tris、甘氨酸、十二烷基硫酸鈉（購自南京榮勝達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；鹽酸（購自揚(yáng)州滬寶化學(xué)試劑有限公司）。

1.1.3 主要儀器 FL-4600熒光分光光度計(jì)，購自日本日立高新技術(shù)公司；UV-6100紫外/可見光分光光度計(jì)，購自上海元析儀器有限公司；T-25型數(shù)顯勻漿機(jī)，購自德國IKA公司；M124A電子天平，購自意大利Bel公司；便攜式pH計(jì)，購自美國奧豪斯公司；HJ-8（DF-1）集熱式磁力攪拌器，購自常州國華電器有限公司；Jasco-715圓二色譜儀，購自日本Jasco公司；真空冷凍干燥機(jī)，購自德國Christ公司；Uni Cen MR冷凍離心機(jī)，購自德國Herolab公司；超聲波細(xì)胞破碎儀，購自寧波新芝生物科技股份有限公司；多功能微孔板檢測儀，購自美國Bio Tek公司；激光粒度分析儀（Nano-ZS 90），購自英國Malvern公司；超純水機(jī)（Milli-Q），購自美國Millipore公司；Q20差式量熱掃描儀，購自美國TA公司；JS-680C全自動(dòng)凝膠成像分析儀，購自上海培清科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同超聲時(shí)間試驗(yàn)用血漿蛋白粉制取 將未經(jīng)超聲處理的血漿蛋白粉20 g溶于400 mL雙蒸水中獲得5%溶液，分別將溶液經(jīng)超聲波細(xì)胞破碎儀用固定頻率150 W 超聲處理0、5、10、20、30 min，得到5種不同處理的樣品。對不同超聲時(shí)間的溶液表面皿封存，凍干得到蛋白粉備用。

1.2.2 血漿蛋白物化性質(zhì)的測定

1.2.2.1 SDS-PAGE凝膠電泳測蛋白分子量及蛋白質(zhì)種類

上樣前處理：取20μL蛋白樣品，加入5μL上樣緩沖液（pH值8.8的0.06 mol/L Tris-HCl緩沖液、2.0% SDS、5.0% β-巰基乙醇、25.0%甘油、0.1%溴酚藍(lán)）混合，于95℃條件下反應(yīng)5 min，12 000 r/min離心5 min，取15～20μL處理后樣品上樣，同時(shí)制備12%分離膠和5%濃縮膠。采用分子量蛋白Marker（11～135 ku）作為對照。電泳緩沖液為0.025 mol/L Tris-HCl、0.192 mol/L甘氨酸、0.1% SDS，電泳先在電壓80 V進(jìn)行20～30 min，后在120 V電泳至條帶與膠底面平行。電泳結(jié)束后，采用考馬斯亮藍(lán)R-250染色20～30 min，然后用脫色液（甲醇∶乙酸∶水＝1∶1∶8）脫色，直至可清楚地辨別條帶。

1.2.2.2 圓二色譜測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu) 采用圓二色譜儀測定樣品溶液的近紫外圓二光譜變化。將制備的樣品配制成濃度為0.5 mg/mL蛋白溶液，注入1 mm厚的樣品池。設(shè)定圓二色譜儀參數(shù)為：掃描范圍190～250 nm，掃描速度50 nm/min，光譜間隔1.0 nm。得到CD數(shù)據(jù)以平均橢圓率表示，采用CDPro軟件進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)分析。

1.2.2.3 熒光光譜 采用10 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH值7.0）將樣品溶液配制成蛋白濃度為0.2mg/mL。熒光光譜采用激發(fā)波長為290 nm掃描，測定的發(fā)射波長范圍為300～460 nm，狹縫寬度均為2.5 nm。每個(gè)樣品測定重復(fù)3次。

1.2.2.4 表面疏水性的測定 將樣品配制成10 mg/mL的蛋白溶液，后采用0.01mol/L PBS緩沖溶液（pH值7.0）將樣品液稀釋1、2、4倍。取4.0 mL稀釋后的蛋白溶液與20μL 80 mmol/L ANS磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH值為7.0）混勻，室溫下放置2 min后測定熒光強(qiáng)度。設(shè)置參數(shù)為：激發(fā)波長371 nm，發(fā)射波長467 nm，掃描速率240 nm/min，狹縫寬度10 nm。得到數(shù)據(jù)以蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度（mg/mL）對熒光強(qiáng)度作圖，采用線性回歸分析進(jìn)行曲線擬合，直線斜率即是蛋白質(zhì)的表面疏水性（H0）指數(shù)。

1.2.2.5 自由巰基含量測定 準(zhǔn)確量取0.5 mL質(zhì)量濃度為10 mg/mL的蛋白液樣品，后加入2.50 mL Tris-Gly-8M Urea溶液和0.02 mL 4 mg/mL的DTNB溶液，迅速混合后于25℃反應(yīng)25 min，波長412 nm下測定吸光度（D412nm），并以蒸餾水作空白對照。每個(gè)樣品做3次平行試驗(yàn)，最終結(jié)果取其平均值，并按公式（1）進(jìn)行計(jì)算：

式中：73.53＝106/（1.36×104），1.36×104為Ellman試劑的摩爾消光系數(shù)；D412nm為波長412 nm下所測得的吸光值；C為蛋白質(zhì)樣品的質(zhì)量濃度，單位為mg/mL；D為稀釋因子，在游離巰基測定中D值取為6.04。

1.2.2.6 差式掃描量熱 取樣品3～6 mg用差示量熱掃描儀（DSC）進(jìn)行掃描，掃描溫度為室溫至20℃，掃描速度為5℃/min（程序升溫），所有的測定都要在氮?dú)猸h(huán)境下進(jìn)行。最大變性溫度（Tmax）用Ver 1.2 N Software（TA Instruments）分析。

1.2.2.7 粒徑分布 超聲處理和未超聲的血漿蛋白粒度分布采用Nano-ZS90激光粒度儀進(jìn)行測定，介質(zhì)為蒸餾水，折射率為1.361，測定時(shí)以蒸餾水為背景。設(shè)置物質(zhì)折射率為1.52，加入樣品至遮光率達(dá)10%～20%后，進(jìn)行信息采集。每個(gè)樣品平行采集3次，取平均圖譜。

1.2.2.8 Zeta電位分析 Zeta-電位（ζ，mV）也用Nano-ZS90激光粒度儀來測定。采用超純水將蛋白質(zhì)溶液稀釋成0.5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），加入樣品電位測量池測量。ζ是通過電導(dǎo)遷移率（UE）采用激光多普勒測速技術(shù)結(jié)合相分析光散射來計(jì)算。

1.2.2.9 掃描電鏡 將超聲處理和未超聲的蛋白冷凍干燥后進(jìn)行掃描電子顯微鏡觀測。操作流程：將樣品置于樣品臺，經(jīng)離子濺射儀真空干燥、金粉噴鍍后，調(diào)節(jié)電鏡加速電壓為20 kV，對樣品進(jìn)行觀測攝圖。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

上述所有試驗(yàn)均3次重復(fù)，結(jié)果表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”。采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，Origin 9.0作圖，采用組間ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Turkey檢驗(yàn)用于組間數(shù)據(jù)分析，P＜0.05表示兩組間差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 血漿蛋白凝膠電泳分析

將不同超聲處理時(shí)間的雞血血漿蛋白樣品上樣進(jìn)行SDS-PAGE分析，檢測并比較不同超聲處理時(shí)間雞對血漿蛋白亞基組成的影響。由圖1可知，不同超聲時(shí)間的雞血漿蛋白條帶其清晰度和數(shù)目均無明顯差異［10］，各雞血漿蛋白的亞基分子量主要集中在43～95 ku，蛋白條帶完整，無雜碎條帶，該結(jié)果表明不同超聲時(shí)間處理并未改變雞血血漿蛋白的亞基組成［11］。

2.2 圓二光譜

圓二色性主要由肽鍵的電子躍遷引起，因此圓二色譜可反映蛋白質(zhì)主鏈肽鍵的構(gòu)象，其遠(yuǎn)紫外（190～250 nm）能夠提供蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)（α-螺旋，β-折疊，β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲）含量信息［12-13］，是檢測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化的重要指標(biāo)，可根據(jù)遠(yuǎn)紫外圓二光譜來分析蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。由圖2可知，雞血漿蛋白在超聲功率150W 下處理0、5、10、20、30 min，雞血漿蛋白在209 nm和222 nm處有2個(gè)負(fù)峰，在193 nm處有1個(gè)正峰，這是典型的α-螺旋結(jié)構(gòu)特征峰［14］。不同超聲時(shí)間處理的蛋白其圖譜幾乎無改變，且α-螺旋含量大致相同，此結(jié)果與表1數(shù)據(jù)相符，說明本試驗(yàn)中不同的超聲處理時(shí)間并沒有破壞血漿蛋白的二級結(jié)構(gòu)，這與王金梅等的結(jié)論［15］一致。β-折疊含量高則α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角含量低，β-折疊含量低則α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角含量高，而無規(guī)則卷曲幾乎不變，這說明α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和β-折疊之間存在著一種相互轉(zhuǎn)化關(guān)系，維持一種動(dòng)態(tài)平衡。

2.3 熒光光譜

熒光光譜通過測定樣品蛋白質(zhì)中部分能產(chǎn)生熒光的氨基酸殘基（色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸）可推測其蛋白構(gòu)象的變化趨勢，這是表征蛋白質(zhì)分子構(gòu)象發(fā)生變化的一種常用手段［16］，通過熒光強(qiáng)度和峰位變化可反映蛋白質(zhì)局部三級結(jié)構(gòu)的變化［17］。由圖3可知，雞血漿蛋白的最大發(fā)射熒光強(qiáng)度在335 nm處改變，但不同處理時(shí)間雞血漿蛋白的最大發(fā)射熒光強(qiáng)度波長位置基本不變，但是超聲處理5、10、20 min的血漿蛋白熒光強(qiáng)度高于超聲0 min血漿蛋白，這可能是由于雞血漿蛋白經(jīng)超聲處理后，超聲波產(chǎn)生的機(jī)械效應(yīng)和空化效應(yīng)使蛋白內(nèi)部肽鏈伸展程度變大，暴露出部分掩埋于分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)，從而熒光強(qiáng)度發(fā)生了增強(qiáng)［18］。賈俊強(qiáng)等通過超聲處理麥胚清蛋白后其熒光強(qiáng)度發(fā)生明顯增強(qiáng)［19］，本結(jié)果與之一致。而超聲30 min雞血漿蛋白熒光強(qiáng)度明顯下降且最大發(fā)射峰強(qiáng)峰位較對照組有較小程度的紅移，這可能是由于蛋白質(zhì)分子間作用力而發(fā)生了熒光猝滅作用［20］。該結(jié)果還說明不同超聲處理時(shí)間可改變雞血漿蛋白分子的高級構(gòu)象［21］。

表1 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)含量信息

2.4 雞血漿蛋白表面疏水性測定

表面疏水性是蛋白質(zhì)重要的表面性質(zhì)，研究表明表面疏水性是影響蛋白質(zhì)功能特性的重要因素，對保持蛋白質(zhì)穩(wěn)定構(gòu)象和生物活性具有重要作用［22］。熒光探針法是測定蛋白質(zhì)疏水性最廣泛的方法，其優(yōu)點(diǎn)是蛋白用量少，操作簡單便捷［23］。ANS探針熒光在水溶液中單獨(dú)存在時(shí)，熒光量子產(chǎn)量較低，隨著ANS與蛋白質(zhì)結(jié)合，熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，通過這一特性可以表征雞血漿蛋白的表面疏水性［24］。由圖4可知，經(jīng)過不同超聲時(shí)間處理的雞血漿蛋白表面疏水性顯著提高，這可能是由于超聲波的空穴效應(yīng)，導(dǎo)致雞血漿蛋白質(zhì)相互碰撞后發(fā)生卷曲、折疊，蛋白結(jié)構(gòu)被破壞，在水溶液中暴露出疏水性氨基酸殘基，更多的血漿蛋白與ANS相結(jié)合，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，其表面疏水性顯著提高［25］。賈俊強(qiáng)等發(fā)現(xiàn)通過超聲頻率為1 800W 的超聲波處理后小麥胚芽球蛋白溶液的表面疏水性提高了［26］。超聲10 min雞血漿蛋白與超聲5 min雞血漿蛋白相比表面疏水性下降了，但是其差值不及超聲20 min與超聲10 min的差值。表面疏水性下降可能是因?yàn)殡S著超聲處理時(shí)間的提高，蛋白質(zhì)間相互作用加強(qiáng)，蛋白質(zhì)的表面疏水性增加，當(dāng)表面疏水相互作用達(dá)到一定程度時(shí)蛋白質(zhì)的亞基聚集形成共價(jià)鍵及氫鍵等結(jié)構(gòu)，使得一部分疏水基團(tuán)被包埋，疏水相互作用減弱，疏水性降低［27-28］。超聲處理20 min和30 min的血漿蛋白疏水性顯著低于超聲處理10 min的蛋白樣品，這可能是超聲處理使雞血漿蛋白間的相互作用達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，疏水性保持穩(wěn)定。

2.5 自由巰基

巰基基團(tuán)含量變化可反映蛋白質(zhì)變性程度，對探究蛋白的功能性質(zhì)利用有重要作用［29］。由圖5可知，在超聲5 min、超聲10 min、超聲20 min組別中，經(jīng)過超聲處理的血漿蛋白其自由巰基含量提高，這可能是由于超聲處理破壞了蛋白分子間的二硫鍵和巰基互相轉(zhuǎn)化［30］，使埋藏在蛋白分子內(nèi)的巰基暴露出來，蛋白分子空間結(jié)構(gòu)得到伸展［31］。Hu等發(fā)現(xiàn)，超聲處理增加了大豆分離蛋白的游離疏基含量［32］，本試驗(yàn)結(jié)果與之一致。在超聲處理30 min組自由巰基含量出現(xiàn)明顯下降，這可能是由于長時(shí)間超聲處理使得蛋白質(zhì)中部分—SH被重新氧化成S—S［33］，使巰基基團(tuán)被重新包埋。蛋白質(zhì)自由巰基含量還受到其他因素影響，試驗(yàn)操作中溫度的改變或樣品溶液的復(fù)雜性都會改變自由巰基含量［27，34］。同時(shí)，不同超聲處理時(shí)間下雞血漿蛋白樣品的巰基變化趨勢與疏水性相似，這可能是由于超聲時(shí)間增加，蛋白質(zhì)變性程度增加，同時(shí)蛋白質(zhì)分子間相互作用形成更多的蛋白質(zhì)聚集體。

2.6 差式掃描量熱

由表2可知，雞血漿蛋白熱掃描出現(xiàn)2組溫度數(shù)據(jù)，這是血漿蛋白中2種主要蛋白（白蛋白和球蛋白）的變性溫度及熱焓變，與Dergez等研究［35］一致。經(jīng)過超聲處理的血漿蛋白變性溫度較對照組均有所下降，且大致呈逐步下降趨勢，雞血漿蛋白對熱的敏感性增強(qiáng)。這可能是超聲處理影響了血漿蛋白的熱穩(wěn)定性，使血漿蛋白的三級結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，空間立體性增加，蛋白與蛋白之間的交聯(lián)發(fā)生改變，這與史培磊等的試驗(yàn)結(jié)果［36］相類似。

2.7 粒徑分布

不同超聲處理時(shí)間（0、5、10、20、30 min）對雞血漿蛋白粒徑的影響見圖6。由圖6可知，經(jīng)過超聲處理的血漿蛋白明顯平均粒徑均低于未超聲處理的樣品［37］。但還可以看到粒徑并沒有隨著超聲時(shí)間的增加而持續(xù)減小，超聲30 min雞血漿蛋白粒徑大于超聲20 min組，同時(shí)超聲5 min的血漿蛋白粒徑跨度即粒徑圖寬度顯著變大，而其他超聲時(shí)間下蛋白粒徑又存在減小現(xiàn)象，說明可能蛋白分子一部分發(fā)生了分解作用，一部分發(fā)生了聚集作用。這一結(jié)果與葉鈺等的研究結(jié)果［38］一致，而出現(xiàn)這一現(xiàn)象的本質(zhì)原因可能是超聲過程中的空化作用產(chǎn)生極強(qiáng)的剪切力，破壞了蛋白質(zhì)分子間的共價(jià)或非共價(jià)作用［39］，使粒徑分布較大的血漿蛋白分子分解成較小的蛋白質(zhì)分子。

表2 血漿蛋白的差式量熱掃描數(shù)據(jù)

2.8 蛋白表面電荷

Zeta電位是表征膠體分散系穩(wěn)定性的重要指標(biāo)，可近似用來表示表面電荷。Zeta電位的絕對值越大，說明膠體的體系越穩(wěn)定；反之，Zeta電位絕對值越小，蛋白質(zhì)分子排斥力會小于吸引力，分子會有吸引聚集的趨勢［40］。由圖7可知，經(jīng)過固定頻率超聲處理的血漿蛋白其Zeta電位絕對值都大于未超聲處理組，這與Ryan等的研究結(jié)果［41］一致。Schmitt等認(rèn)為Zeta電位絕對值大于20 mV，膠體較穩(wěn)定［42］，所以經(jīng)過超聲處理的血漿蛋白穩(wěn)定性增強(qiáng)。本研究中經(jīng)過超聲處理的血漿蛋白穩(wěn)定性增強(qiáng)明顯。

2.9 掃描電鏡

由圖8可知，隨著超聲時(shí)間的增加，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)出現(xiàn)孔隙，變得疏松甚至分離，表面結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，這符合超聲處理產(chǎn)生的剪切力破壞了分子間氫鍵和范德華力，使蛋白質(zhì)發(fā)生分散，形成更加寬松的層狀結(jié)構(gòu)［43］。這與馮景麗等采用超聲處理酪蛋白表面微觀結(jié)構(gòu)變得片層化和“空洞”化［44］是一致的。

3 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明，超聲處理不會破壞雞血漿蛋白的亞基組成和二級結(jié)構(gòu)，但會顯著影響蛋白的三級結(jié)構(gòu)、表面性質(zhì)、粒徑分布和表面微觀形態(tài)。在超聲頻率不變時(shí)，改變超聲時(shí)間對血漿蛋白的作用效果不是呈現(xiàn)相關(guān)性增長，而是一種不確定的改變，并不是超聲時(shí)間越長達(dá)到的效果越好，根據(jù)實(shí)際需要達(dá)到的效果可選擇最適超聲時(shí)間。而本研究證明超聲對改變蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)的有效性，為超聲處理蛋白質(zhì)改善蛋白質(zhì)的功能特性利于其應(yīng)用于生活中提供了理論基礎(chǔ)。