韓金龍，童曉利，曹榮祥，蔣立奔，闞家亮，李 慧

（1.江蘇丘陵地區(qū)南京農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇南京 210046；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所/江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210014）

梨是我國(guó)主栽的三大果樹之一，在南北方均有栽植。隨著氣候變暖，極端天氣增多，春季寒潮時(shí)有發(fā)生，影響梨樹成花率和成花質(zhì)量，嚴(yán)重制約了我國(guó)梨產(chǎn)業(yè)的發(fā)展［1］。梨樹設(shè)施栽培可通過改變光照、溫濕度等生態(tài)因子，促進(jìn)梨樹的物候期提前［2］，減少不良?xì)夂蛞蜃拥挠绊懀瑥亩纳评婀麑?shí)品質(zhì)，提早上市。避雨栽培是果樹設(shè)施栽培中的一種集約化栽培方式［3］，主要是在果園搭建聚乙烯塑料薄膜固定式避雨設(shè)施。目前避雨栽培在葡萄［4］、大櫻桃［5］、芒果［6］等樹種上均有相關(guān)研究，研究主要集中在果樹病害防控和果實(shí)品質(zhì)提優(yōu)等方面，對(duì)果樹成花影響的報(bào)道較少。

溫度是調(diào)節(jié)果樹物候期最重要的影響因素［7-9］。研究表明，花芽萌發(fā)期的環(huán)境變化與成花質(zhì)量具有密切關(guān)系［10］。果樹開花期前1個(gè)月對(duì)平均溫度的變化最為敏感［9］。而土壤濕度直接決定開花時(shí)間和花芽萌發(fā)狀況［11-13］。除此之外，物候期也與降水量的多少有一定的相關(guān)性［14-16］。通過改善果樹樹冠層的溫濕度、土壤濕度及光照強(qiáng)度，可影響樹體的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和生殖生長(zhǎng)。因此，利用避雨栽培設(shè)施，改變梨樹生長(zhǎng)微環(huán)境，可影響梨樹成花。

果樹成花要經(jīng)過花芽分化期、花芽休眠期和花芽萌發(fā)期3個(gè)階段，每個(gè)階段的轉(zhuǎn)變都會(huì)受到一系列基因的表達(dá)調(diào)控，而開花過程也需要相關(guān)基因的啟動(dòng)與調(diào)節(jié)［17］。LEAFY（LFY）基因和FLOWERING LOCUST（FT）基因是模式植物花器官轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵基因，對(duì)植物成花起著正相關(guān)調(diào)控作用［18］。目前，在蘋果、桃和葡萄等果樹上已分離出成花相關(guān)基因，它們?cè)诓煌ㄆ鞴僦衅鹬{(diào)控果樹成花的作用［19-21］。在梨上亦分離出LFY和FT的同源基因，但僅局限于花芽分化階段的研究［22］，對(duì)它們?cè)诶鏄溟_花過程中的具體表達(dá)特點(diǎn)尚不清楚。本研究通過比較露地和避雨2種栽培條件下梨園微環(huán)境的差異，分析花芽外觀形態(tài)特征與相關(guān)成花基因的表達(dá)特點(diǎn)，明確避雨栽培對(duì)梨樹成花情況與開花質(zhì)量的影響，為梨樹在南方地區(qū)避雨栽培模式的推廣提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料處理

試驗(yàn)在江蘇徐淮地區(qū)徐州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所果園基地進(jìn)行，供試材料為以杜梨為砧木，生長(zhǎng)健壯、生長(zhǎng)勢(shì)基本一致的5年生蘇翠1號(hào)和翠冠梨品種，株行距3 m×5 m，采用紡錘形樹形。試驗(yàn)分2個(gè)處理：（1）果園露地栽培梨樹；（2）果園避雨栽培梨樹（避雨設(shè)施高6 m，只在下雨天進(jìn)行避雨）。從花芽萌動(dòng)期到謝花期每周采樣2次，每次每個(gè)品種每種處理隨機(jī)采集20個(gè)花芽，12個(gè)用于花芽外觀形態(tài)特征觀察，8個(gè)立即用液氮處理保存，用于花芽相關(guān)成花基因表達(dá)分析。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 果園生態(tài)因子記錄 從2017年3月初（花芽萌動(dòng)期）開始至2017年4月中下旬（落花期），用空氣溫濕度自動(dòng)記錄儀和土壤濕度記錄儀分別記錄果園露地與避雨設(shè)施下空氣溫濕度（樹冠層）和土壤濕度變化，每隔2 h記錄1次，分析空氣日平均溫濕度、平均土壤濕度及其日變化規(guī)律。

1.2.2 梨成花率統(tǒng)計(jì) 從花芽萌動(dòng)開始，每種栽培模式下每個(gè)梨品種在相同的方位隨機(jī)選取新梢10枝，固定標(biāo)記編號(hào)，分別統(tǒng)計(jì)成花率和開花率，計(jì)算公式如下：

成花率＝∑（花芽數(shù)/總芽數(shù)）/重復(fù)數(shù)×100%；

開花率＝∑（開花數(shù)/花芽數(shù)）/重復(fù)數(shù)×100%。

1.2.3 花芽外觀形態(tài)特征觀察 每周選取周一和周四2天觀察比較不同栽培模式下，花芽萌發(fā)階段的梨花芽外觀形態(tài)特征。

1.2.4 成花基因（LFY、FT）的表達(dá)分析 采用改良的CTAB法提取梨花芽的總RNA，用1%瓊脂糖膠檢測(cè)RNA質(zhì)量，并利用核酸分析儀NanoDrop（Thermo）檢測(cè)濃度，于-70℃保存?zhèn)溆?。?μL總RNA為模版，參照AceQ qPCR SYBR Green Master Mix（南京諾唯贊生物科技有限公司）說明書，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并以qPCact基因［23］為內(nèi)參基因，進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)目的基因［22］的表達(dá)水平（引物序列見表1）。qPCR反應(yīng)進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)，定量結(jié)果采用2-ΔΔCT方法進(jìn)行分析。

表1 熒光定量PCR所用引物

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 采用Microsoft Excel 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和圖表繪制，SPSS軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同栽培模式下溫濕度變化

2.1.1 空氣溫度變化規(guī)律 由圖1可以看出，避雨栽培對(duì)梨園溫度變化影響較小。自花芽萌動(dòng)期到謝花期，隨著時(shí)間的推移，2種模式下空氣溫度整體的變化趨勢(shì)表現(xiàn)一致，氣溫不斷升高，且避雨條件氣溫較露地條件平均高0.19℃。圖2顯示，避雨和露地條件下氣溫日變化都表現(xiàn)為06：00“低—高—低”的變化趨勢(shì)，一天中氣溫最高出現(xiàn)在14：00，最低出現(xiàn)在06：00；從夜間00：00到14：00，避雨條件氣溫較露地條件平均高0.19℃，其中10：00的氣溫相差最大（避雨條件較露地條件高0.74℃），但差異不明顯。

2.1.2 空氣濕度規(guī)律 由圖3可知，從花芽萌動(dòng)到謝花階段，避雨和露地條件下空氣濕度變化趨勢(shì)完全一致，且避雨條件較露地條件日空氣相對(duì)濕度相差2.0%～8.8%（平均高5.1%）。圖4顯示，避雨和露地條件下，空氣相對(duì)濕度呈現(xiàn)中午低、早晚高的現(xiàn)象，其中最高出現(xiàn)在06：00，最低出現(xiàn)在14：00。一天中避雨條件較露地條件空氣相對(duì)濕度相差1.9%～10.2%（平均高5.3%），其中在10：00相差最大，在18：00相差最小。

2.1.3 土壤濕度規(guī)律 避雨和露地條件下，土壤相對(duì)濕度變化如圖5所示，從花芽萌動(dòng)期到謝花期，避雨和露地條件下的土壤相對(duì)濕度出現(xiàn)相同趨勢(shì)的波動(dòng)，避雨條件較露地條件土壤相對(duì)濕度平均高3.7%，但兩者之間的差距在逐漸減小。圖6顯示，一天內(nèi)避雨條件下的土壤相對(duì)濕度變化較為平緩，相差最大僅為0.7%，露地條件下的土壤相對(duì)濕度總體變化呈先升高后降低的趨勢(shì)，相對(duì)濕度最大出現(xiàn)在14：00，最小出現(xiàn)在04：00，兩者相差2.6%。

2.2 不同栽培模式下梨成花狀況比較

2.2.1 梨成花率和開花率比較 由表2得知，避雨條件和露地條件對(duì)梨樹形成總芽數(shù)的影響不明顯，但是對(duì)花芽的形成（成花率）及開花質(zhì)量存在差異性影響。避雨條件下，蘇翠1號(hào)和翠冠的成花率分別達(dá)到了78.3%和54.9%，較露地條件提高了5.6百分點(diǎn)和7.4百分點(diǎn)；在開花率方面，避雨條件也較露地條件分別提高了17.6百分點(diǎn)和4.5百分點(diǎn)。這表明避雨栽培對(duì)梨樹新梢總芽數(shù)的形成無明顯影響，但能有效提高梨樹的花芽形成率及開花率。

2.2.2 花芽萌發(fā)外觀形態(tài)特征比較 由圖7可知，在相同的栽培條件下，蘇翠1號(hào)物候期較翠冠提前，蘇翠1號(hào)花芽發(fā)育較翠冠花芽早，但2種梨花芽形態(tài)外觀差異逐漸減小，且開花期一致。在不同栽培模式下，同一品種梨花芽的萌發(fā)過程存在差異，即避雨栽培較露地栽培的梨物候期提前；避雨栽培梨花芽花序分離期較早且花柄伸長(zhǎng)較快；從3月23日到3月30日，避雨栽培的梨花柄明顯較露地栽培的長(zhǎng)且分離角度大，整個(gè)形態(tài)特征也較露地栽培大。隨后避雨栽培梨較露地栽培提前進(jìn)入開花期，比較梨花形態(tài)可知，避雨栽培梨與露地栽培梨落花期（4月13日）無明顯差異，避雨栽培使梨開花周期延長(zhǎng)。

表2 2種梨在不同栽培模式下開花率調(diào)查

2.3 成花基因表達(dá)情況比較

2.3.1 PbLFY基因的表達(dá)分析 由圖8可知，在梨花芽萌動(dòng)到落花過程中，不同栽培模式下PbLFY基因在不同品種中的表達(dá)變化趨勢(shì)相同。在花芽萌動(dòng)期到開花前（3月6日到3月30日），PbLFY基因在蘇翠1號(hào)和翠冠中均呈現(xiàn)表達(dá)下調(diào)趨勢(shì)，且PbLFY基因在蘇翠1號(hào)中的表達(dá)量始終高于翠冠；在花柄伸長(zhǎng)及花蕾分離期（3月27日到3月30日）該基因表達(dá)量始終維持在較低水平。在開花期（4月6日至4月13日），PbLFY基因在2個(gè)品種中表達(dá)量均上調(diào)，蘇翠1號(hào)的表達(dá)高峰出現(xiàn)在4月10日，翠冠的表達(dá)峰值出現(xiàn)在4月13日，2個(gè)梨品種在避雨栽培模式下PbLFY基因表達(dá)峰值分別是露地栽培的1.86倍和2.01倍，這表明PbLFY基因可能參與了花芽早期萌動(dòng)的進(jìn)程，不參與梨花器官成熟的調(diào)控，且對(duì)梨開花過程起正調(diào)控作用。

2.3.2 PbFT基因的表達(dá)特點(diǎn) 由圖9可知，PbFT基因在梨花芽萌動(dòng)到落花過程中，在不同栽培模式下的表達(dá)變化趨勢(shì)相似，表達(dá)量均呈現(xiàn)“升高-降低-升高-降低”的過程，且整個(gè)花期物候期，PbFT基因在避雨栽培條件下的表達(dá)量始終高于露地栽培。在花芽萌動(dòng)初期，PbFT基因的表達(dá)量維持在一個(gè)穩(wěn)定的水平；在花序即將分離時(shí)，PbFT基因的表達(dá)量出現(xiàn)第1個(gè)表達(dá)高峰，此時(shí)2個(gè)梨品種在避雨栽培模式下的PbFT基因表達(dá)量分別為露地栽培的1.39倍和1.92倍，蘇翠1號(hào)出現(xiàn)在3月16日，翠冠出現(xiàn)在3月20日，隨后其表達(dá)短暫下調(diào)，在花序分離后期（3月27日），PbFT基因在蘇翠1號(hào)和翠冠中的表達(dá)量同時(shí)達(dá)到峰值，且避雨栽培模式下的PbFT基因表達(dá)量分別是露地栽培的1.53倍和1.50倍，之后PbFT基因的表達(dá)呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)，并維持在較低水平。這表明，PbFT基因可能參與了花芽萌動(dòng)初期調(diào)控，對(duì)花序分離及花柄伸長(zhǎng)有正相關(guān)調(diào)控作用；該基因在蘇翠1號(hào)中的調(diào)控啟動(dòng)早于翠冠。

3 討論

避雨栽培通過搭建聚乙烯篷布來改善梨樹生長(zhǎng)微環(huán)境，既可以為梨樹生長(zhǎng)提供一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的環(huán)境，也可防御春季寒潮造成的經(jīng)濟(jì)損失，避免外界不利環(huán)境因子帶來的影響。開花是一個(gè)復(fù)雜的形態(tài)建成過程，是外界環(huán)境和內(nèi)部因子共同協(xié)同作用的結(jié)果［24］。本研究發(fā)現(xiàn)，避雨條件可以改善果園微環(huán)境，日平均溫度較露地條件高0.2℃左右，日空氣平均濕度較露地條件高5.1%，日土壤平均濕度較露地條件高3.7%，這與李延菊等對(duì)大櫻桃避雨栽培的研究結(jié)果［5］相似，即避雨栽培模式能夠提高空氣溫濕度及土壤濕度。而在梨樹開花前，空氣溫濕度的提高有利于延長(zhǎng)花粉壽命，促進(jìn)花粉萌發(fā)、花粉管生長(zhǎng)，進(jìn)而提高果實(shí)的座果率［25］。因此，梨樹開花質(zhì)量對(duì)提高果園經(jīng)濟(jì)效益起著至關(guān)重要的作用。比較2種模式下蘇翠1號(hào)和翠冠梨的成花率和開花率后發(fā)現(xiàn)，避雨栽培能夠有效提高它們的成花率（分別提高5.6百分點(diǎn)和7.4百分點(diǎn)）和開花率（分別提高為17.6百分點(diǎn)和4.5百分點(diǎn)）。這表明避雨栽培可通過改善果園微環(huán)境，從而提高梨樹的成花率和開花率。

觀察梨花芽萌動(dòng)始的整個(gè)開花過程后發(fā)現(xiàn)，避雨栽培能夠促進(jìn)梨花期物候期提前［1］，延長(zhǎng)開花周期［2］，這可能與避雨栽培可改善果園微環(huán)境有直接關(guān)系。梨園微環(huán)境的改變有效誘導(dǎo)了梨成花相關(guān)基因PbLFY和PbFT的表達(dá)。研究表明，PbLFY和PbFT基因都表現(xiàn)促進(jìn)成花的作用，只是促進(jìn)成花的時(shí)期有所不同［22］。本研究發(fā)現(xiàn)，梨相關(guān)成花基因PbLFY在梨開花前（3月30日前），在不同栽培條件下的梨花芽中的表達(dá)量均呈逐漸降低趨勢(shì)；在梨花期（4月6日至4月13日），PbLFY基因表達(dá)上調(diào)，其中在蘇翠1號(hào)中表達(dá)量呈先上調(diào)后下調(diào)的趨勢(shì)，在翠冠中表達(dá)量則呈現(xiàn)持續(xù)上調(diào)，且在此期間避雨條件下表達(dá)量均明顯增加。這表明，避雨條件能明顯提高梨相關(guān)成花基因PbLFY在開花期間的表達(dá)量，這可能是避雨條件能夠延長(zhǎng)梨開花周期的原因［26］。梨相關(guān)成花基因PbFT在整個(gè)花期的表達(dá)量會(huì)出現(xiàn)2個(gè)表達(dá)高峰，且避雨條件下的表達(dá)量均明顯高于露地條件，這表明基因PbFT在梨開花過程中起著正調(diào)控作用［27］，也是導(dǎo)致避雨條件下花期物候期提前的原因；基因PbFT在蘇翠1號(hào)和翠冠中的表達(dá)量分別在3月16日和3月20日達(dá)到第1個(gè)小高峰，這與它們進(jìn)入花蕾分離期的時(shí)間相吻合，表明基因PbFT對(duì)梨花芽花蕾分離起正調(diào)控作用，與花器官的成熟密切相關(guān)［22］。

綜上所述，避雨栽培能夠提高梨園空氣溫濕度和土壤濕度，有效改善梨園微環(huán)境，促進(jìn)梨相關(guān)成花基因PbLFY和PbFT的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，促進(jìn)整體物候期提前，延長(zhǎng)開花周期，提高梨成花率、開花率及改善花生長(zhǎng)狀況。