劉穎新，劉利利，毛群芳，彭麗英，陳 容

(湖南中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校 藥學(xué)系，湖南 株洲 412012)

四物湯來源于《仙授理傷續(xù)斷秘方》一書，是臨床上補血、活血兼顧的代表方劑。四物湯由熟地、當(dāng)歸、白芍、川芎四味藥配伍組成，主要用于治療營血虛滯所致的血虛失養(yǎng)、月經(jīng)不調(diào)[1-2]等癥。前期研究表明，四物湯補血作用有效部位為多糖、二氯甲烷和正丁醇部位。基于中藥復(fù)方協(xié)同作用，本研究采用均勻設(shè)計法對四物湯中3種起補血作用的主要部位進行配伍研究，以篩選出四物湯補血有效部位的最優(yōu)配比，并對配比后的有效部位補血機制進行了探討。

1 動物、試藥與儀器

SPF級雌性昆明小鼠，體質(zhì)量18～22 g(長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(湘)2014-0011)。

熟地、白芍、當(dāng)歸、川芎均購于長沙佰佳藥材公司，經(jīng)湖南中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校生藥教研室羅紅梅副教授鑒定，分別為玄參科植物地黃(RehmanniaglutinosaLibosch.)的炮制加工品、毛茛科植物芍藥(PaeonialactifloraPall.)的干燥根、傘形科植物當(dāng)歸(Angelicasinensi(Oliv.)Diels.)的干燥根和傘形科植物川芎(LigusticumchuanxiongHort.)的干燥根莖。自行提取，分離得到多糖部位、二氯甲烷部位和正丁醇部位備用。環(huán)磷酰胺(批號：17052531，0.2g/支，江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司)，驢膠補血顆粒(批號：201706058，20 g/袋，九芝堂股份有限公司)。Na+-K+-ATP酶活性檢測試劑盒(批號：160506，南京建成生物工程研究所)；白細(xì)胞介素-3(IL-3)及促紅細(xì)胞生成素(EPO)ELISA檢測試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)。

BC-5000型血液細(xì)胞分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)；Model 680型酶標(biāo)儀(美國BIO-RAD公司)；JA2603B型電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。

2 方法

2.1 動物模型的制備

參照文獻(xiàn)[3-4]，采用ip環(huán)磷酰胺的方法制備小鼠血虛模型。小鼠ip給予環(huán)磷酰胺生理鹽水溶液40 mg/kg，連續(xù)3 d。

2.2 分組與給藥

將提取的四物湯多糖、二氯甲烷和正丁醇3個補血有效部位作為考察因素，根據(jù)前期研究的有效劑量和相關(guān)文獻(xiàn)[5]，分別確定3個部位的劑量范圍為多糖1 000～1 600 mg/kg、二氯甲烷15～75 mg/kg、正丁醇14～62 mg/kg。按照U7(76)均勻設(shè)計表安排試驗，得到均勻設(shè)計試驗方案，見表1。將實驗動物100只，隨機分成10組，每組10只，采用ip環(huán)磷酰胺復(fù)制小鼠骨髓造血功能抑制模型，以外周血象、脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)為考察指標(biāo)。根據(jù)表2方案，按劑量配比配制灌胃液，ig給藥，同時設(shè)對照組和驢膠補血顆粒陽性藥物組，陽性藥物組按12.13 g/kg劑量ig給予驢膠補血顆粒(按照臨床給藥劑量2倍折算成動物給藥劑量)。實驗動物適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，對照組每天ig 0.5 %CMC-Na，連續(xù)8 d。模型組每天ig 0.5%CMC-Na，連續(xù)8d，并在第4天起ip CTX(40 mg/kg)，連續(xù)給藥3 d。各給藥組每天ig不同配比的有效部位灌胃液，共8 d，并于開始給藥的第4天起ip CTX(40 mg/kg)，連續(xù)3 d。陽性藥物組每天ig驢膠補血顆粒共8 d，于第4天起ip CTX(40 mg/kg)，連續(xù)3d。于第9天將各組試驗動物摘眼球取血適量，一部分用于血常規(guī)檢測，另一部分用于紅細(xì)胞膜中Na+-K+-ATP酶活性和IL-3、EPO含量測定。

表1 因素水平表 (mg/kg)

表2 給藥方案 (mg/kg)

2.3 指標(biāo)檢測

各組動物于第9天采用摘眼球取血適量，置于抗凝EP管(EDTA)中，通過血細(xì)胞分析儀檢測血常規(guī)，指標(biāo)包括紅細(xì)胞計數(shù)(RBC)、紅細(xì)胞比容(HCT)、血紅蛋白(HGB)等3項指標(biāo)。測定Na+-K+-ATP酶的活性，嚴(yán)格按試劑盒說明書要求進行測定，酶活性以每毫克蛋白每小時所產(chǎn)生的無機磷的量來表示(單位：μmol·mg-1·h-1)。另取適量全血置于無抗凝劑的EP管中，按照ELISA試劑盒說明書要求測定血清中IL-3和EPO含量。

2.4 統(tǒng)計學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 四物湯有效部位不同配比對血虛模型小鼠外周血象的影響

結(jié)果見表3，與對照組比較，模型組小鼠HCT、RBC、HGB明顯降低(P<0.01)。與模型組比較，給藥A、B、G組明顯升高HCT、RBC(P<0.05、P<0.01)；C、E組明顯升高HCT、RBC、HGB(P<0.05)；D組明顯升高HCT和HGB(P<0.05)；F組RBC升高和HGB作用顯著(P<0.01)。

表3 四物湯有效部位不同配比對血虛模型小鼠外周血象的影響

注：與對照組比較：#P<0.05,##P<0.01；與模型組比較：*P<0.05,**P<0.01，下同；#P<0.05,##P<0.01 vs contrl group;*P<0.05,**P<0.01 vs model group,same as below。

表4 指標(biāo)評分

3.2 四物湯補血有效部位最優(yōu)配比

分別以HCT、RBC、HGB綜合得分為指標(biāo)，經(jīng)二次多項式逐步回歸法對數(shù)據(jù)進行處理，經(jīng)二次多項式逐步回歸，得到回歸方程：

Y=86.8+7.62×10-3X1+3.29×10-2X2+0.265X3-2.57×10-4X1X3-2.88×10-4X32(X1為多糖部位，X2為二氯甲烷部位，X3為正丁醇部位)。方程經(jīng)過調(diào)整后r=0.9999，S=0.0685，F(xiàn)=1091，F(xiàn)0.05(5,1)=230.2,F>F0.05(5,1)，回歸方程顯著。此方程中各因素的最優(yōu)配比為：X1=1 600mg/kg；X2=75mg/kg；X3=14 mg/kg。

3.3 四物湯補血有效部位配比優(yōu)化方的驗證

KM小鼠50只，隨機分為5組，每組10只。分別為對照組、模型組、陽性對照組(驢膠補血顆粒12.13 g/kg)、四物湯補血有效部位配比優(yōu)化方組(即多糖1 600mg/kg+二氯甲烷部位75mg/kg+正丁醇部位14mg/kg)和四物湯組(生藥6.37 g/kg)。按2.2項方法給藥，以HCT、RBC和HGB作為藥效學(xué)評價指標(biāo)，結(jié)果見表5。配比優(yōu)化方組RBC和HGB與模型組相比，差異非常顯著(P<0.01)，HCT與模型組比較，差異顯著(P<0.05)。與四物湯組相比，配比優(yōu)化組對HCT、RBC和HGB的升高作用與四物湯組相當(dāng)，表明經(jīng)優(yōu)化后的組方有較好的補血效果。

表5 配比優(yōu)化方驗證試驗結(jié)果

3.4 四物湯有效部位配比優(yōu)化方對IL-3、EPO及紅細(xì)胞膜Na+-K+-ATP酶活性的影響

與對照組比較，模型組IL-3、EPO含量和Na+-K+-ATP酶水平降低非常顯著(P<0.01)。與模型組比較，配比優(yōu)化方能顯著升高IL-3和Na+-K+-ATP 酶水平(P<0.05)；升高EPO水平作用非常顯著(P<0.01)。結(jié)果見表6。

表6 配比優(yōu)化方對紅細(xì)胞膜Na+-K+-ATP酶活性、IL-3及EPO的影響

4 討論

我國中藥配伍理論是傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)之精華。利用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論、技術(shù)與數(shù)學(xué)理論相結(jié)合深入探究中藥配伍內(nèi)涵，進一步闡明藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，是中醫(yī)藥現(xiàn)代化的要求和任務(wù)[7]。均勻設(shè)計將數(shù)論和多元統(tǒng)計相結(jié)合，尤其適用于多因素和多水平的試驗研究。在條件變化范圍大且需要較多水平試驗的情況下，與正交設(shè)計相比，可明顯減少試驗次數(shù)，并通過回歸方程得出最佳實驗條件[8-10]。本試驗采用均勻設(shè)計對四物湯中3種補血有效部位進行最佳配比研究，實驗結(jié)果表明，四物湯3個有效部位的7種組合均有不同程度的補血作用。經(jīng)均勻設(shè)計得到的回歸方程所預(yù)測的最佳配比療效確切，并與四物湯原方療效相當(dāng)，表明運用均勻設(shè)計法結(jié)合藥效學(xué)試驗優(yōu)化中藥有效部位配比的方法是可行的。

白細(xì)胞介素-3(IL-3)，又名多向集落刺激因子(multi-CSF)，它由T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，是細(xì)胞因子家族中的一員。IL-3屬于正向調(diào)節(jié)性因子，能夠調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞的增殖與分化，對造血細(xì)胞尤其是對巨核細(xì)胞有重要的調(diào)節(jié)功能[11-13]。本研究中，模型組小鼠與對照組比較血液中的IL-3含量顯著降低，四物湯補血有效部位配比優(yōu)化方對小鼠血液中的IL-3含量影響顯著，推測配比優(yōu)化方補血作用是通過調(diào)節(jié)IL-3的生成而起作用。促紅細(xì)胞生成素(EPO) 是一種特異性作用于紅系祖細(xì)胞的激素糖蛋白，它在機體中對紅細(xì)胞的生成有增強作用，當(dāng)紅細(xì)胞數(shù)量減少或攜氧能力下降時，可刺激腎臟生成和釋放EPO,促進骨髓內(nèi)紅細(xì)胞的生成[14-15]。本研究結(jié)果表明，與空白對照組比較，模型組小鼠血清中EPO水平明顯降低，這可能是由于紅系祖細(xì)胞被大量破壞，從而造成血清中EPO水平明顯降低。四物湯配比優(yōu)化方可促使血清中EPO水平明顯升高，表明配比優(yōu)化方可以促進腎臟大量合成EPO進入血清。Na+-K+-ATP酶作為一種存在于細(xì)胞膜上的跨膜蛋白，它可以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的Na+、K+離子濃度，維持正常膜電位和細(xì)胞滲透壓。Na+-K+-ATP酶對于維持正常紅細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)、功能具有重要作用[16,17]。血虛證最主要的病理表現(xiàn)是紅細(xì)胞數(shù)量減少，研究表明，紅細(xì)胞數(shù)量的減少可引起機體的新陳代謝減慢，從而導(dǎo)致紅細(xì)胞膜上Na+-K+-ATP酶活性隨機體新陳代謝的減弱而降低。本研究中，四物湯配伍優(yōu)化方組與模型組比較能夠顯著提高Na+-K+-ATP酶活性，使紅細(xì)胞恢復(fù)到正常的形態(tài)和功能。

綜上所述，經(jīng)過均勻設(shè)計優(yōu)化后得到的四物湯有效部位配比方在補血效果上與四物湯原方相當(dāng)，成分更清楚，質(zhì)量更易控制，符合中醫(yī)藥現(xiàn)代化的要求。其補血作用可能與增強Na+-K+-ATP酶活性，提高IL-3和EPO水平有一定相關(guān)性。