鄒蔓姝，韓遠山，王宇紅

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；3.湖南省中藥粉體與創(chuàng)新藥物省部共建國家重點實驗室培育基地，湖南 長沙 410208)

丹參(Salviamiltiorrhiza)為唇形科鼠尾草屬植物丹參干燥的根及根莖，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品[1]。丹參具有祛瘀止痛、活血通經(jīng)、清心除煩等功效，為活血化瘀的著名中藥[2]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，丹參中作用于心血管的主要有效成分為水溶性酚性物質(zhì)[3-4]，其中尤以丹酚酸B含量最高，活性最強。傳統(tǒng)丹酚酸的提取方法為水回流提取，得到的水溶性雜質(zhì)多，且純化工藝步驟繁瑣，操作復(fù)雜，成本高[5]。大孔樹脂是近年來發(fā)展起來的一種以吸附和分子篩原理相結(jié)合的分離材料，具有穩(wěn)定性高、選擇性好、再生處理方便、吸附速率快、不受無機鹽類、強離子和低分子化合物影響的優(yōu)勢[6-8]。利用大孔樹脂吸附分離技術(shù)對丹參提取液進行分離純化，以丹酚酸B含量為指標(biāo)，通過靜態(tài)和動態(tài)吸附-解吸附變化，考察最佳分離純化條件，并優(yōu)化其工藝，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與材料

1.1 儀器

AY120 Shimadzu電子分析天平(Shimadzu Corporation Japan)；98-1C型數(shù)字控溫電熱套(天津市斯特儀器有限公司)；SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵(上海亞榮生化儀器廠)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠，RE-52A )；TL9900數(shù)據(jù)處理軟件；SK2200HP超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司，功率250 W，頻率30 kHz)；PHS-25酸度計(上海雷磁儀器廠)；TU-1901型雙光束紫外分光光度計(北京普析通用儀器責(zé)任有限公司)；Agilent1100高效液相色譜儀(美國HP公司)；Hypersil BDS C18色譜柱(Thermo)(4.6 mm×200 mm，5 μm)；HA121-50-01型超臨界萃取裝置(江蘇南通華安超臨界萃取有限公司)；SA-6000自動血流變測試儀(北京賽科希德科技發(fā)展有限公司)。

1.2 試劑

丹參酮IIA(批號：110766-201520，中國食品藥品檢定研究院，純度≥98%)；丹酚酸B(批號：111562-201615，中國食品藥品檢定研究院，純度≥99%)；丹參藥材(由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供)；色譜甲醇(SPECTAUM)；色譜乙腈(SPECTAUM)；冰醋酸(湖南匯虹試劑有限公司)；大孔吸附樹脂：D101(天津農(nóng)藥股份有限公司)；HPD100，HPD600(滄州寶恩化工廠)；AB-8，NK-II，SIPI905(南開大學(xué)化工廠)。

1.3 動物

SPF級雄性SD大鼠48只，體重180～220 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司(動物許可證號 SCXK(湘)2013-0004)。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品制備

2.1.1 乙醇超聲提取 參照《動植物藥有效成分提取分離和藥理活性篩選匯編》方法[9]，取丹參藥材100 g，加10倍量乙醇浸泡12 h，再加5倍乙醇超聲提取2次，每次1h，合并提取液，減壓濃縮至干，加水溶解后，采用大孔樹脂吸附純化，以50%乙醇洗脫，得洗脫液，減壓濃縮至干，編號為①。

2.1.2 不同濃度乙醇提取 參照《中國藥典》2015年版一部復(fù)方丹參片中丹參提取方法，取丹參藥材100 g加8倍量乙醇回流提取1.5 h，過濾，濾液回收乙醇，減壓濃縮至干，備用；藥渣加6倍量50%乙醇回流提取1.5 h，過濾，濾液回收乙醇，減壓濃縮至干，備用；藥渣加6倍量水提取2 h，過濾，濾液減壓濃縮至干，備用；合并上述浸膏，編號為②。

2.1.3 SFE-CO2萃取 取丹參藥材100 g，采用SFE-CO2萃取，以萃取壓力22 MPa、溫度40 ℃、解析壓力22 MPa、溫度40 ℃、夾帶劑為30%藥材量的乙醇的條件對丹參脂溶性成分進行萃取，得萃取物備用；藥渣同“2.1.1”項下處理，所得浸膏與萃取物合并，編號為③。

2.2 三種工藝樣品的化學(xué)成分比較

以丹參酮IIA和丹酚酸B的提取量為考查指標(biāo)，對3種工藝制備的樣品進行化學(xué)成分比較研究。參照中國藥典2015年版一部丹參項下丹酚酸B、丹參酮IIA含量測定方法進行檢測。

2.2.1 色譜條件 丹酚酸B：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；乙腈-0.02%磷酸水為流動相，進行梯度洗脫；柱溫為20 ℃；檢測波長為270 nm。丹參酮IIA：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；乙腈-0.1%磷酸水(22∶78)；柱溫為20 ℃；流速為1.2 mL/min；檢測波長為286 nm。兩者理論塔板數(shù)均不低于6 000。

2.2.2 對照品溶液制備 精密稱取丹酚酸B對照品10 mg，置于100 mL容量瓶中，加甲醇-水(8∶2)至刻度，搖勻，即得(丹酚酸B濃度0.1 mg/mL)。精密稱取丹參酮IIA對照品10 mg，置于50 mL棕色容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻；精密量取2.5 mL，置于25 mL棕色量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得(丹參酮IIA濃度20 μg/mL)。

2.2.3 供試品溶液制備 取上述3種樣品浸膏，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定重量，加熱回流1 h，取出，放冷，再稱定重量，用甲醇溶液補足減失的重量，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 測定法 分別精密吸取兩種對照品溶液與三種供試品溶液各10 μL，依次注入液相色譜儀，測定，即得。結(jié)果表明，采用SFE-CO2萃取后藥渣再醇提的方法優(yōu)于其他兩種提取方法。見表1。

表1 不同提取方法對提取率的影響

注：指100g丹參藥材中丹酚酸B、丹參酮IIA的提取量；丹參藥材中丹酚酸B的含量不少于3.0%、丹參酮IIA的含量不少于0.25%。

2.3丹參不同提取液對大鼠血液流變學(xué)參數(shù)的影響

2.3.1 動物造模方法及分組 先給予大鼠皮下注射大劑量腎上腺素模擬暴怒時機體狀態(tài)，再以冰水浸泡模擬寒邪侵襲，二者綜合作用可迅速復(fù)制出血液流變性呈黏、濃、凝、聚的模型[10-12]。因血瘀模型形成較迅速，故采用預(yù)防性實驗治療[13]，即先給藥7 d，待活血化瘀作用出現(xiàn)時，再開始造模。取雄性SD大鼠48只，按體重隨機分為空白對照組，血瘀模型組，陽性藥物組(復(fù)方丹參片)，丹參①、②、③組。給藥組每日灌胃給藥1次，連續(xù)給藥7 d，空白對照組和血瘀模型組大鼠給予等體積生理鹽水。第7 天給藥1 h后，除空白對照組外，其他各組大鼠均皮下注射鹽酸腎上腺素注射液0.08 mL/100 g，共2次，每次間隔4 h，在兩次注射之間，將大鼠放入0℃冰水中，浸泡5 min后取出?？瞻讓φ战M大鼠皮下注射等體積的生理鹽水，且不放入冰水中。

2.3.2 測定指標(biāo) 所有大鼠禁食12 h，次晨股動脈采血，3% EDTA抗凝，測定纖維蛋白原，另用肝素抗凝，采用血流變測試儀測定血液流變學(xué)指標(biāo)。

2.3.3 結(jié)果 模型組大鼠全血黏度、血漿黏度、紅細胞壓積指數(shù)高于正常對照組。與模型組相比，藥物組大鼠全血黏度、血漿黏度、紅細胞壓積指數(shù)、纖維蛋白原，紅細胞聚集指數(shù)等明顯降低。組間比較可得，丹參①和丹參③具有較好的改善血液流變學(xué)的作用，兩者之間無顯著性差異(P<0.05)，但效果皆明顯優(yōu)于丹參②?？紤]工藝的簡化和穩(wěn)定以及節(jié)約成本因素，宜選擇乙醇超聲提取。見表2、表3。

表2 丹參不同提取液對大鼠血液流變學(xué)參數(shù)的影響

注：與空白對照組比較，++P<0.01，+P<0.05；血瘀模型組比較，**P<0.01，*P<0.05。

表3 丹參不同提取液對大鼠血液流變學(xué)參數(shù)的影響

注：與血瘀模型組比較，**P<0.01，*P<0.05。

2.4 樣品制備與大孔吸附樹脂前處理

2.4.1 供試品溶液制備 取“2.1.1”項下干浸膏粉末，加水溶解成濃度為0.3 g生藥/mL(含丹酚酸B為9.9 mg/mL)的供試品溶液備用。

2.4.2 對照品溶液的制備 取丹酚酸B對照品，加蒸餾水制成0.12 mg/mL濃度的溶液，備用。

2.4.3 大孔樹脂前處理 稱取適量各型號大孔樹脂，無水乙醇浸泡24 h后裝柱，加乙醇靜止浸泡4 h后，以2 BV/h流速通過樹脂柱至洗脫液加水不出現(xiàn)白色渾濁，蒸餾水洗至無醇味；5%HCl浸泡洗脫4 h，體積流量4 BV/h，蒸餾水洗至流出的洗脫液呈中性，0.2%NaOH浸泡洗脫4 h，體積流量4 BV/h，蒸餾水洗至流出的洗脫液呈中性。

2.5 丹酚酸B含量測定

分別精密吸取對照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，分別置于10 mL量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻，作為不同濃度的對照品溶液。分別于286 nm波長處測定吸光度，以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=0.03824X+0.001 7，相關(guān)系數(shù)r2=0.9995，表明丹酚酸B在10.0～90.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)與吸光度值線性關(guān)系良好。

2.6 吸附洗脫特性參數(shù)

比上柱量S：達吸附終點時，單位質(zhì)量干樹脂吸附夾帶成分的和。S=(上柱液中成分質(zhì)量-過柱流出液中成分質(zhì)量)/干樹脂質(zhì)量。

比吸附量A：單位質(zhì)量干樹脂吸附成分的總和。A=(上柱液中成分質(zhì)量-過柱流出液中成分質(zhì)量-洗脫成分質(zhì)量)/干樹脂質(zhì)量。

比洗脫量E：吸附飽和后，用一定量溶劑洗脫至終點，單位質(zhì)量干樹脂洗脫成分的質(zhì)量。E= 洗脫成分質(zhì)量/干樹脂質(zhì)量。

2.7 影響吸附的因素考察

2.7.1 吸附樹脂的篩選 按照“2.4.3”項下的方法對5種樹脂進行預(yù)處理，取適量(相當(dāng)于1 g干樹脂)處理后的樹脂，裝入玻璃柱中。將質(zhì)量濃度為9.9 mg/mL的丹參樣品液1 mL，加于各柱頂，先用水以相同的流速洗脫，再用10%、20%、30%乙醇梯度洗脫，分段收集過柱殘液與水洗液，供含量測定用。根據(jù)計算結(jié)果可知，不同樹脂對丹酚酸B的吸附與解吸附效果有差別，其中在SIPI905與D101樹脂的比上柱量和比洗脫量都較大，說明這兩種型號的樹脂吸附與解吸附的性能較強，較宜選擇使用。見表4。

表4 丹酚酸B的吸附和洗脫量

2.7.2 吸附速率測定 按照“2.4.3”項下的方法對5種樹脂進行預(yù)處理，取適量(相當(dāng)于1 g干樹脂)處理后的5種樹脂，置于具塞錐形瓶中，加樣品液2 mL，至恒溫震蕩器中室溫振蕩，分別于0、2、4、6、8、18 h取樣，測定樣品液中丹酚酸B的含量，計算樹脂對樣品的比吸附量，根據(jù)以下公式計算吸附速率。結(jié)果表明，SIPI905樹脂的吸附速率最快，綜合考慮2個因素，以選擇SIPl905樹脂為佳。見表5。

Kt=-ln(1-Qt/Q)。注：Kt：吸附速率常數(shù)；T：吸附時間；Qt：t時間內(nèi)的吸附量；Q：平衡吸附量。

表5 不同樹脂類型對丹酚酸B的吸附速率 K(h-1)

2.7.3 樣品濃度對吸附效果影響 按照“2.4.3”項下的方法對SIPI905樹脂進行預(yù)處理，稱取6份處理后的樹脂，濕法裝柱。將6份丹酚酸B質(zhì)量濃度為0.5750、0.8625、1.1500、1.4375、1.7254、2.3000 mg·mL-1的樣品液2 mL，分別加于各柱頂，用水以相同流速通過大孔樹脂，待完全吸附后，測定吸附后樣品液中丹酚酸B含量，計算比吸附量。從結(jié)果可以看出，隨著樣品液濃度的增加，比吸附量也相應(yīng)增加，且比吸附量與樣品的濃度之間符合弗蘭德里希(Freundlich)吸附等溫式和朗繆爾(Langmuir)方程，由此可見二者之間主要以物理吸附為主。見表6。

表6 樣品濃度對大孔樹脂吸附的影響

注：C0上柱樣品丹酚酸B的濃度，X/M比吸附量。對Frendlich公式擬合：lgX/M=1.0265lgC0+0.8562，r=0.9818；對Langmuir公式擬合：1/X/M=0.1289/C0+0.0092，r=0.9723。

2.7.4 鹽溶液對吸附效果的影響 按照“2.4.3”項下方法對SIPI905樹脂進行預(yù)處理，稱取5份(相當(dāng)于1 g干樹脂)預(yù)處理后的SIPI905型樹脂置于具塞錐形瓶中，加入2 mL丹參樣品液，再分別往瓶中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0%、4%、8%、12%、16%NaCl溶液1 mL。于25 ℃、120 r/min水浴恒溫恒速振蕩1h，抽濾得上清液，測量濾液中丹酚酸B含量并計算樹脂的比上柱量。從表7數(shù)據(jù)可以看出，鹽溶液的存在會使比上柱量減小，因此樣品液中應(yīng)避免鹽類。見表7。

表7 鹽溶液濃度對大孔樹脂吸附的影響

2.7.5 溫度對吸附效果的影響 按照“2.4.3”項下方法對SIPI905樹脂進行預(yù)處理，稱取5份等量(相當(dāng)于1 g干樹脂)預(yù)處理后的SIPI905型樹脂置于具塞錐形瓶中，并加入2 mL丹參樣品液，放置在120 r/min的振蕩器中，于20℃、30℃、40℃、50℃、60℃條件下震蕩1 h，抽濾得上清液，測定濾液中丹酚酸B含量。結(jié)果表明，溫度對吸附純化的效果影響較大，在室溫范圍內(nèi)對吸附影響較小，比上柱量隨著溫度的升高而下降。見表8。

表8 溫度對大孔樹脂吸附的影響

2.7.6 最大上樣量的確定 按照“2.4.3”項下方法對SIPI905樹脂進行預(yù)處理，稱取處理后的SIPI905型樹脂適量5份(相當(dāng)于5g干樹脂)，分別裝入5根層析柱，加樣品液5、10、15、20、25 mL，靜置30 min，流出液重吸附3次，再用蒸餾水、20%乙醇各100 mL洗脫，收集20%乙醇洗脫液，測定丹酚酸B含量。結(jié)果表明，上樣量達15 mL后，洗脫液中丹酚酸B含量無顯著性增加，即超過樹脂的吸附容量，因此15 mL為飽和上樣量。見表9。

表9 上柱量對丹酚酸B得量的影響

2.7.7 最佳吸附時間的確定 按照“2.4.3”項下方法對SIPI905樹脂進行預(yù)處理，稱取處理后的SIPI905型樹脂適量5份(相當(dāng)于5 g干樹脂)，分別裝入5根層析柱，取15 mL丹參樣品液上樣，流出液重吸附3次，5根層析柱分別靜置10、15、30、60 min，依次用蒸餾水、20%乙醇各150 mL洗脫，收集20%乙醇洗脫液，測定丹酚酸B含量。結(jié)果表明，靜置30 min時，洗脫液中丹酚酸B含量最高，時間過短，吸附不完全，時間過長，解吸附難。見表10。

2.8 洗脫工藝參數(shù)考察

2.8.1 洗脫溶劑選擇 按照“2.4.3”項下方法對SIPI905樹脂進行預(yù)處理，裝柱(柱內(nèi)徑與長度比為1∶10，干重10 g)，取15 mL丹參樣品液上樣，依次用蒸餾水、10%、20%、30%、50%乙醇各200 mL梯度洗脫，流速為1 mL/min，每50 mL收集1份，共20份；分別蒸干，加蒸餾水溶解，過濾，定容至5 mL，編號，測定丹酚酸B含量。以樣品編號為橫坐標(biāo)，丹酚酸B含量為縱坐標(biāo)，繪制洗脫曲線。結(jié)果表明，20%～30%的乙醇洗脫液中丹酚酸B含量較高，占總得率的88.2%，且解吸附能力20%乙醇強于30%乙醇，故確定洗脫條件為先用蒸餾水洗去雜質(zhì)，再用20%乙醇洗脫丹參中丹酚酸B。見圖1。

表10 吸附時間對丹酚酸B得量的影響

圖1 丹參樣品液洗脫曲線

2.8.2 洗脫溶劑用量的選擇及洗脫率的測定 按照“2.4.3”項下方法對SIPI905樹脂進行預(yù)處理，裝柱(柱內(nèi)徑與長度比為1∶10，干重10 g)，取15 mL丹參樣品液上樣，靜置30 min，先用250 mL蒸餾水洗脫，再用20%乙醇250 mL分次(50 mL/次)洗脫，洗脫液流速為1 mL/min，共收集5份，分別蒸干，用甲醇溶解，過濾，定容至5 mL，分別測定丹酚酸B得量。結(jié)果表明，丹酚酸B集中在前150mL內(nèi)被洗脫，故確定20%乙醇洗脫劑用量為150 mL。見表11。

表11 洗脫溶劑用量對丹酚酸B得量的影響

2.8.3 驗證試驗 取同一批藥材，按照優(yōu)選的工藝條件進行大孔吸附樹脂吸附的驗證試驗，結(jié)果洗脫液中的總固體物得率分別為5.56%、5.49%、5.62%，平均值為5.56%；丹酚酸B得率分別為3.78%、3.57%、3.48%，平均值為3.61%，丹酚酸B得量占固體物量的64.98%，表明大孔樹脂的純化工藝基本合理。工藝條件為1 g丹參提取物，丹參中丹酚酸B的最大上樣量(即比吸附量)為9.20 mg/g，洗脫劑為20%乙醇，用量為150 mL。

2.8.4 樹脂再生的考察 按照“2.4.3”項下方法對SIPI905樹脂進行預(yù)處理，取適量(相當(dāng)于1 g干樹脂)處理后的樹脂，裝入玻璃柱中。取1 mL丹參樣品液進行上柱、吸附和洗脫，在同一根樹脂上重復(fù)操作5次，分別計算5次丹酚酸B的吸附量。結(jié)果表明，樹脂經(jīng)連續(xù)使用3次后吸附率下降，應(yīng)考慮對樹脂進行再生處理。見表12。

表12 樹脂重復(fù)利用次數(shù)對丹酚酸B吸附量的影響

3 討論

本實驗采用3種提取方法同時提取丹參中兩種有效成分丹參酮IIA和丹酚酸B，以兩者的提取率，結(jié)合抗心肌缺血實驗的血液流變參數(shù)為評價指標(biāo)，考察并確定該兩種成分的最佳提取工藝。采用超聲技術(shù)提取丹參有效成分，利用超聲波的特性可加速藥物有效成分進入溶劑。脂溶性成分丹參酮具有活血化瘀的作用[14]，但對熱不穩(wěn)定，在提取、純化、干燥過程中易降解，若要提高其保留率，需采用超臨界萃取工藝?？剐募∪毖饕幮г囼灲Y(jié)果表明，SFE-CO2萃取樣品較乙醇超聲提取樣品的藥效作用稍強，但經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理組間無顯著性差異，為降低成本，簡化工藝，保證質(zhì)量穩(wěn)定，宜采用乙醇超聲提取。

在此基礎(chǔ)上，本實驗從樹脂選擇、上樣流速、樣品濃度、溫度等方面考察并得到水溶性成分丹酚酸B的最佳純化工藝參數(shù)，通過驗證表明其純化效果較好。SIPI905大孔樹脂具有吸附“大、快、高”及再生處理方便等優(yōu)點，其吸附性與篩分性相結(jié)合的特點尤適合于丹參中丹酚酸B的分離、純化。樹脂對有效成分的吸附一般分為四個階段：①溶液中外擴散；②樹脂表面液膜擴散；③樹脂內(nèi)部孔徑擴散；④吸附和解吸附。丹酚酸B在大孔樹脂上的吸附隨著溫度的升高，吸附量下降，說明該吸附過程屬于放熱過程，降低溫度有利于吸附。吸附量與藥液符合弗蘭德里希(Freundlich)吸附模型和朗繆爾(Langmuir)方程，即在達到平衡吸附之前，同一溫度下，濃度越大，吸附量也會增大。

大孔樹脂吸附分離技術(shù)已日益顯示其獨特的效果，不僅為中藥制劑質(zhì)量控制研究提供了更有效、可靠的純化富集手段，更重要的是改善了傳統(tǒng)中藥制劑“粗、大、黑”的外觀和服用量過大等缺點。目前，實驗室階段的研究日益增多，有助于后期工業(yè)化的大規(guī)模應(yīng)用，今后若大孔吸附樹脂技術(shù)可以與其他技術(shù)相結(jié)合，將能為中藥的分離純化、產(chǎn)品開發(fā)提供更可靠的保證。