李昊月，張美慧，李瑞海*

(1．沈陽市紅十字會醫(yī)院，遼寧 沈陽 110013；2．遼寧中醫(yī)藥大學 藥學院，遼寧 大連 116600)

大棗在中國古代方劑中的應(yīng)用很多，如《傷寒論》中使用大棗的方劑有40多首，棗的活性成分成為大家關(guān)注的熱點。研究發(fā)現(xiàn)，大棗主要含有環(huán)磷酸腺苷(cAMP)、紅棗低聚糖、無刺棗芐苷Ⅱ和蘆丁等成分。祖國醫(yī)學認為大棗味甘，性溫，歸脾、胃、心經(jīng)，具有補中益氣、養(yǎng)血安神的功效，可用于脾虛食少、乏力便溏、婦人臟躁的治療。氨基酸也是大棗的主要有效成分，具有很強的生物活性。筆者實驗室曾嘗試采用柱前衍生化高效液相色譜法對一些中藥材中氨基酸含量進行測定，積累了一些經(jīng)驗。本研究擬采用此法建立大棗中氨基酸的含量測定方法，并對不同產(chǎn)地大棗中18種氨基酸含量進行測定，以期為大棗的質(zhì)量評價提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

氨基酸自動分析儀(P230II，大連依利特公司)；紫外檢測器(UV230II，大連依利特公司)；電子分析天平(ALC-110.4，北京賽多利斯特儀器系統(tǒng)有限公司)；數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-4，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司)；高速粉碎儀器機(SF-130B，上海冠聯(lián)制藥裝備有限公司)；電熱恒溫鼓風干燥箱(DHG-9070A型，上海精宏實驗設(shè)備有限公司)。

1.2 試藥與材料

18種氨基酸對照品(中國食品藥品檢定研究院，20100108)，衍生化試劑(2,4-二硝基氟苯)(大連依利特公司)。固體組分A、固體組分B (大連依利特公司，20100212)。乙腈為色譜純；冰醋酸、N,N-二甲基酰胺為分析純；水為純凈水。大棗經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學尹海波教授鑒定符合藥典要求。見表1。

表1 大棗的廠家、產(chǎn)地和批次

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[1]

色譜柱：ODS(4.6 mm×250 mm，5 μm，大連依利特)，柱溫：27 ℃，檢測波長：360 nm；流速：1.2 mL·min-1，梯度洗脫。具體程序見表2。

表2 流動相梯度洗脫程序

2.2 流動相配制

A相∶乙腈-水(1∶1)；B相：固體組分B 4.1 g加水950 mL，冰醋酸調(diào)節(jié)pH=6.4～6.8，加10 mL N,N-二甲基甲酰胺，加水定容至1 000mL量瓶中，搖勻后過濾，備用。

2.3 衍生緩沖溶液配制

取衍生緩沖溶液固體組分A 1.24 g，固體組分B 7.63 g，加水定容至500 mL量瓶中，搖勻，備用。

2.4 平衡緩沖溶液配制

取平衡緩沖溶液固體組分A 0.91 g，固體組分B 3.58 g，加水定容至250 mL量瓶中，搖勻，備用。

2.5 對照品溶液制備

精密稱取氨基酸對照品適量(丙氨酸5.1 mg、組氨酸5.0 mg、脯氨酸4.9 mg、精氨酸5.3 mg、亮氨酸5.6 mg、絲氨酸4.8 mg、天門冬氨酸5.3 mg、異亮氨酸4.8 mg、蘇氨酸5.0 mg、半胱氨酸5.0 mg、賴氨酸5.0 mg、色氨酸5.1 mg、谷氨酸5.0 mg、蛋氨酸4.9 mg、纈氨酸4.9 mg、甘氨酸4.9 mg、苯丙氨酸5.6 mg、酪氨酸2.7 mg)。加衍生緩沖溶液定容至25mL容量瓶中，精密吸取1mL，加衍生緩沖溶液定容至10mL容量瓶中，備用。

2.6 供試品溶液制備

取大棗樣品粉末0.03 g，精密稱定，置于具塞試管中，加3 mL 6 mol·L-1鹽酸溶液[2]，混勻，置于烘箱110 ℃中水解24 h。水解后樣品多次用水洗滌，從具塞試管轉(zhuǎn)入蒸發(fā)皿中，80 ℃水浴加熱蒸干。衍生緩沖溶液多次洗滌蒸發(fā)皿，轉(zhuǎn)入25 mL容量瓶中，用衍生緩沖溶液定容，混勻，0.45 μm微孔濾膜過濾。取已過濾的樣品液2 mL，置于10 mL棕色容量瓶中，加入衍生化試劑1 mL ，放入60 ℃水浴中暗處反應(yīng)1 h，取出冷卻至室溫，加平衡緩沖溶液定容至刻度，靜置15 min，0.45 μm微孔濾膜過濾，備用。

2.7 標準曲線繪制

取“2.5”項下25 mL容量瓶中對照品溶液0.01、0.50、1.00、1.50、2.00 mL，分別置于10 mL棕色容量瓶中，分別加入衍生化試劑0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，按照“2.6”項下方法制備。按照“2.1”項下色譜條件進樣測定，進樣量為20 μL，以各個氨基酸對照品溶液的進樣量為橫坐標X(μg)，相對應(yīng)的峰面積值為縱坐標Y，繪制標準曲線。各個氨基酸的回歸方程及線性范圍見表3。

表3 各氨基酸成分的回歸方程及線性范圍

2.8 方法學考察

2.8.1 精密度試驗 取對照品溶液，按照“2.1”項下色譜條件，連續(xù)進樣6次測定，18種氨基酸各峰面積的RSD在0.57%～1.15%之間，表明精密度良好。

2.8.2 重現(xiàn)性試驗 取6份樣品適量(過40目篩，每份約30 mg)，精密稱定，按照“2.6”項下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項下色譜條件進樣測定，18種氨基酸含量的RSD在0.50%～1.29%之間，表明此方法具有良好的重現(xiàn)性。

2.8.3 穩(wěn)定性試驗 取山西供試品溶液，按照“2.1”項下色譜條件，分別于2、4、8、10、12、24 h進樣測定，18種氨基酸峰面積的RSD在0.35%～0.99%之間，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8.4 加樣回收率試驗 分別取已知氨基酸含量的山西樣品6份粉末適量(過40目篩，每份約30 mg)，精密稱定，并分別精密加入對照品溶液適量(從天冬氨酸至酪氨酸分別加入對照品3.146 0、0.981 0、4.108 0、0.826 0、5.696 0、0.644 0、2.637 0、2.376 0、1.310 0、0.189 0、0.277 0、1.371 0、2.719 0、1.687 0、0.930 0、0.399 0、1.527 0和0.766 0 mg)，按照“2.6”項下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項下色譜條件，進樣測定，18種氨基酸峰面積的RSD在0.82%～2.38%之間，符合相關(guān)要求。

2.9 大棗中氨基酸含量測定

分別精密吸取各供試品溶液5 μL，按照“2.1”項下色譜條件，進樣測定，樣品及對照品色譜圖見圖1、圖2。根據(jù)標準曲線回歸方程，計算各氨基酸的含量，結(jié)果見表4。

圖1 對照品色譜

圖2 大棗(山西)樣品色譜

表4 不同產(chǎn)地大棗18種氨基酸含量 (mg/g)

3 討論

大棗中含有18種氨基酸，包括8種人體必需氨基酸，種類較為豐富。其中產(chǎn)自新疆的大棗人體必需氨基酸總含量最高，達209.22 mg/g，氨基酸總量也高達737.07 mg/g，總體質(zhì)量較好；相對較差的是山西產(chǎn)大棗，氨基酸總量和人體必需氨基酸含量不及新疆產(chǎn)的一半。

本實驗所建立的大棗中18種氨基酸含量的測定方法簡單易行、科學合理，適用于大棗中氨基酸成分的質(zhì)量控制。