胡立紅，孫 萍

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330004；2.江中藥業(yè)股份有限公司，江西 南昌 330049)

花青素(anthocyanidin)作為一類廣泛存在于植物中的水溶性色素，具有類黃酮的典型結(jié)構(gòu)[1-3]，是一種天然抗氧化劑，具有抗衰老、清除自由基、抗炎、調(diào)節(jié)血脂、抗癌、改善視力等多種功能[4-6]。與合成色素比較，天然色素安全性較高，對人體的危害相對較小[7]，歐洲將花青素含量≥24%的色素提取物作為藥用，其中歐洲越橘(品種VmyrtillusL.)花青素的提取物(myrtocyan)已被意大利、德國等國家的藥典收載[8]。近年來研究陸續(xù)證明花青素具有一系列生理保健功效，篤斯越橘作為果蔬中含抗氧化成分最豐富的一種資源，抗氧化能力很強(qiáng)，并具有促進(jìn)視紅素再合成、抗炎抗菌、提高免疫力、抗心血管疾病、抗衰老和抑制癌癥細(xì)胞發(fā)生等藥理學(xué)功效[9-11]。

由于篤斯越橘在所有果蔬中花青素含量最高[12]，且我國的篤斯越橘種植產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，以篤斯越橘為原料生產(chǎn)花青素具有較好的資源優(yōu)勢。目前關(guān)于篤斯越橘花青素的研究主要涉及提取純化工藝技術(shù)以及穩(wěn)定性試驗(yàn)方面，絕大多數(shù)試驗(yàn)以篤斯越橘鮮果為實(shí)驗(yàn)對象，而篤斯越橘作為季節(jié)性水果且不易保存，不利于工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)。因此，筆者以篤斯越橘凍干粉為原料，以篤斯越橘凍干粉為原料，結(jié)合單因素試驗(yàn)和 Box-Behnken 設(shè)計及響應(yīng)面試驗(yàn)方法優(yōu)化用乙醇浸提法提取篤斯越橘花青素的工藝條件，為篤斯越橘花青素的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

篤斯越橘凍果：品種為篤斯越橘，經(jīng)鑒定為杜鵑花科越橘屬(Vaccinium Spp)漿果類植物果實(shí)，產(chǎn)自大興安嶺，-10℃保存?zhèn)溆谩?/p>

試劑：濃鹽酸；甲醇(分析純)；藥用乙醇(山東龍玉泉藥用輔料有限公司)；飛燕草素對照品(美國ChromaDex公司，批號00004125)。

1.2 儀器與設(shè)備

AB204-S型電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)；UV-1800型紫外可見分光光度計(日本SHIMADZU公司)；TL-5.0臺式離心機(jī)(上海市離心機(jī)械研究院)；LGJ-30F型冷凍干燥機(jī)(北京松源華興科技發(fā)展有限公司)；Delta 320 pH計(梅特勒-托利多儀器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 材料預(yù)處理 挑選成熟度均一的篤斯越橘凍果，解凍、清洗、瀝干、打漿。將果漿冷凍干燥機(jī)中預(yù)凍4 h后，凍干36 h，粉碎，過80目篩，制成凍干粉，于-10℃密封避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 對照品溶液制備 精密稱取飛燕草素對照品5 mg，置于25 mL容量瓶中，加2%鹽酸-甲醇溶解并稀釋至刻度線，搖勻，再精密量取1 mL至25 mL容量瓶中，用2%鹽酸-甲醇稀釋至刻度線，搖勻，即得。

1.3.3 供試品溶液制備 取篤斯越橘凍干粉，精密稱定，放置于100 mL棕色容量瓶中，加入一定體積和確定pH值的乙醇溶液，置于預(yù)先設(shè)定好的水浴溫度下浸提一段時間。提取結(jié)束后，將提取液倒入離心管中，置于冷凍離心機(jī)中以4 000 r·min-1離心10 min。取上清液10 mL，用2%鹽酸-甲醇稀釋至適量，于80 ℃水浴30 min，冷卻。用2%鹽酸-甲醇稀釋至刻度，搖勻，取5 mL于25 mL容量瓶中，用2%鹽酸-甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 精密稱取飛燕草素對照品適量，加2%鹽酸-甲醇制成飛燕草素質(zhì)量濃度為1.10、3.31、5.52、6.62、8.83 μg/mL的對照品溶液。以2%鹽酸-甲醇溶液為空白，采用紫外-可見分光光度法，于540 nm波長處測定吸光度。以吸光度值為縱坐標(biāo)，飛燕草素濃度為橫坐標(biāo)，得回歸方程為y=0.1023x+0.0105，R2=0.99996，飛燕草素在1.104～8.832 μg/mL濃度范圍內(nèi)與其吸光度值線性關(guān)系良好。

1.3.5 樣品測定 以2%鹽酸-甲醇為空白溶劑，取供試品溶液適量于540 nm測定吸光度，計算樣品中飛燕草素的質(zhì)量濃度?；ㄇ嗨氐暮恳燥w燕草素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)計[13]。

1.3.6 花青素提取率計算

1.3.7 單因素試驗(yàn)設(shè)計 在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取溫度、提取時間和pH值5個因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，提取劑乙醇的體積分?jǐn)?shù)分別為40%、50%、60%、70%、80%，料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，水浴溫度為35 ℃、45 ℃、55 ℃、65 ℃、75 ℃，提取時間為30 min、60 min、90 min、120 min、150 min，pH值為1.00、1.50、2.00、2.50、3.00。所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)試驗(yàn)所得的平均值。

1.3.8 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計 在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以乙醇的體積分?jǐn)?shù)、料液比和提取溫度為自變量，花青素提取率為響應(yīng)值。根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計，優(yōu)化出乙醇浸提篤斯越橘花青素的最佳工藝參數(shù)。因素水平設(shè)計如表1所示。

表1 試驗(yàn)設(shè)計因素水平及編碼

1.3.9 數(shù)據(jù)處理 所有試驗(yàn)重復(fù)3次，對每組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，采用SPSS19.0軟件分析結(jié)果的顯著差異；采用 Design Expert ver8.0軟件設(shè)計組合試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇浸提條件對篤斯越橘中花青素提取率的影響

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響 乙醇具有安全低毒、成本低的優(yōu)點(diǎn)，且極性較大，故提取效率高，是提取黃酮類化合物常用的溶劑。乙醇的體積分?jǐn)?shù)對篤斯越橘花青素提取率的影響如圖1所示。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，花青素提取率呈先增加后減少的趨勢，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時，篤斯越橘花青素提取率最高，究其原因可能是根據(jù)相似相容的規(guī)則，花青素易溶于極性大的溶劑中，因此乙醇濃度增大，其極性增大，從篤斯越橘中提取花青素效率會達(dá)到一個閾值，但當(dāng)乙醇提取分?jǐn)?shù)繼續(xù)增大時，提取劑極性相對變小，偏離了篤斯越橘花青素的極性，從而降低了花青素的溶出[14]。因此，當(dāng)提取溶劑的極性與花青素極性一致時，其提取效果最高。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對篤斯越橘花青素提取率的影響

2.1.2 料液比的影響 如圖2所示，花青素的提取率隨著料液比的增大出現(xiàn)先變高后降低的趨勢，這是因?yàn)樘崛∪軇┯昧吭龆?，篤斯越橘凍干粉與溶劑接觸面積增加，更有利于花青素的溶出，當(dāng)達(dá)到飽和狀態(tài)時，增大溶劑用量，會提取出不必要的雜質(zhì)和增加成本[15]；另一方面是因?yàn)樘崛∪軇┯昧吭黾訒?dǎo)致色素濃度降低，從而使分子間作用力降低，直接降低花青素穩(wěn)定性[16]。

2.1.3 提取溫度的影響 如圖3所示，隨著提取溫度升高，花青素提取率提高，提取溫度若繼續(xù)提高，花青素提取率反而會降低。筆者認(rèn)為造成原因如下：①提取溶劑會揮發(fā)且花青素對熱敏感，會發(fā)生降解；②溫度升高，花青素易被氧化，結(jié)構(gòu)被破壞[17]；③花青素在低溫時穩(wěn)定。

圖2 料液比對篤斯越橘花青素提取率的影響

圖3 溫度對篤斯越橘花青素提取率的影響

2.1.4 提取時間的影響 花青素是一類不穩(wěn)定的物質(zhì)，容易受溫度、氧氣、光照等影響，因此在提取花青素的過程中，提取時間的影響不可忽視。由于花青素的不穩(wěn)定性，在一定提取時間范圍內(nèi)，其提取效率會達(dá)到最大值，而后下降，如圖4所示。具體原因如下：①由于空氣氧化作用導(dǎo)致花青素分解從而導(dǎo)致含量降低；②花青素隨提取時間延長而不斷溶出，當(dāng)溶解達(dá)到飽和，提取效率不再增大；③花青素的熱穩(wěn)定性差；④提取時間過長，易產(chǎn)生雜質(zhì)，降低花青素的純度。

圖4 提取時間對篤斯越橘花青素提取率的影響

2.1.5 pH的影響 一般情況下，花青素在酸性條件下更穩(wěn)定[18]，因此pH通?？刂圃?.5～3，通常使用的酸化劑為酒石酸、鹽酸等。從結(jié)構(gòu)上來看，在酸性條件下，花青素以藍(lán)色醌式堿(A)、紅色黃洋鹽陽離子(AH+)、無色甲醇假堿和查耳酮4種形式存在。隨著酸性逐漸變?nèi)?，花青素結(jié)構(gòu)由有色的AH+轉(zhuǎn)變?yōu)锳直到無色甲醇假堿型占據(jù)主導(dǎo)地位。pH過高，花青素會裂解為花色素基元及糖基兩部分，導(dǎo)致花色苷穩(wěn)定性下降；而pH過低可能使花青素的糖基水解，也會導(dǎo)致花青素的穩(wěn)定性下降[19-20]。具體變化如圖5所示。

2.2 響應(yīng)曲面法試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 Box-Benhnken設(shè)計試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計原理，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比和溫度3個因素，對篤斯越橘花青素提取工藝進(jìn)行17次試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見表2。

圖5 pH對篤斯越橘花青素提取率的影響

表2 響應(yīng)曲面法試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果

2.2.2 響應(yīng)面回歸模型 由表3可知，建立篤斯越橘花青素提取率回歸模型的P<0.01，表明回歸模型高度顯著，失擬項(xiàng)P=0.0502>0.05，模型失擬項(xiàng)不顯著，表明模型擬合良好，實(shí)驗(yàn)誤差小，即試驗(yàn)數(shù)據(jù)有意義，可用以預(yù)測各因素對篤斯越橘花青素提取率的影響。根據(jù)表4中各因素P值的大小可知，各因素對篤斯越橘花青素提取影響程度大小為溫度>乙醇體積分?jǐn)?shù)>料液比，且乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比交互作用、料液比和溫度交互作用、乙醇體積分?jǐn)?shù)的二次項(xiàng)、料液比的二次項(xiàng)對篤斯越橘花青素的提取率也存在顯著影響。剔除模型中不顯著項(xiàng)，得到篤斯越橘花青素提取率的回歸方程，即Y=57.58+1.11×A+0.57×B-1.41×C+3.39×A×B+0.52×A×C+4.04×B×C-7.04×A2-6.76×B2-2.54×C2。其中，A為乙醇體積分?jǐn)?shù)(%)，B為料液比(g/mL)，C為溫度(℃)，Y為花青素提取率(%)。

2.2.3 篤斯越橘花青素提取率的響應(yīng)面分析 依據(jù)響應(yīng)曲面得到的回歸方程，建立花青素提取率與試驗(yàn)因素的三維空間的曲面圖，確定花青素提取率最大的工藝條件。如圖6所示，A圖表示當(dāng)溫度為65℃時，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比對花青素提取率交互影響，B圖表示當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%水平時，考察料液比和溫度對花青素提取率交互影響。

根據(jù)表3中各因素P值的大小可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比以及料液比和溫度的交互作用顯著影響花青素的提取率(P<0.05)，其余因素的交互作用不明顯(P>0.05)。等高線的形狀反映交互作用的強(qiáng)弱，圓形表示兩因素交互作用不顯著，而橢圓形表示交互作用顯著。從A、B圖可見：等高線呈現(xiàn)圓形，略有些橢圓，響應(yīng)面坡度陡，說明兩因素的交互作用對花青素的提取率影響較顯著。

表3 回歸模型系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)

圖6 篤斯越橘花青素提取率的響應(yīng)面分析

2.3 最優(yōu)工藝參數(shù)優(yōu)化

在建立篤斯越橘花青素乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、溫度的回歸模型的基礎(chǔ)上，采用中心組合試驗(yàn)設(shè)計(Central Composite Design)對乙醇提取篤斯越橘花青素的工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)選組合，優(yōu)化后的工藝參數(shù)和最優(yōu)結(jié)果如表4所示。

表4 優(yōu)化結(jié)果和驗(yàn)證值

以篤斯越橘花青素提取率最高為導(dǎo)向，所得的最優(yōu)工藝參數(shù)為：乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%、料液比為1∶30、溫度為62 ℃、提取時間為60 min、pH=1.50。在最優(yōu)工藝條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，經(jīng)過3次試驗(yàn)確定的最優(yōu)結(jié)果為58.76%，并且高于響應(yīng)曲面優(yōu)化值57.82%，表明了優(yōu)化結(jié)果的合理性，并且進(jìn)一步驗(yàn)證了回歸模型的適用性。

3 結(jié)論

本研究以篤斯越橘凍干粉為原料，以乙醇為提取溶劑，結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步通過Box-Benhnken 設(shè)計及響應(yīng)面試驗(yàn)，得到篤斯越橘花青素的最優(yōu)提取工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，料液比1∶30，溫度62 ℃，提取時間60 min，pH=1.50。在此工藝條件下驗(yàn)證試驗(yàn)的篤斯越橘花青素提取率可達(dá)58.76%，與預(yù)測值(57.82%)無顯著差異，表明建立的模型能較好地預(yù)測篤斯越橘花青素的提取率。

前期采用酶法提取花青素，但花青素在無細(xì)胞壁包裹的條件下極不穩(wěn)定，且在實(shí)際生產(chǎn)中增加了生產(chǎn)成本。因此，本試驗(yàn)采用乙醇浸提的方法，由于花青素本身性質(zhì)不穩(wěn)定，限制其市場應(yīng)用，因此花青素的穩(wěn)定性以及在生產(chǎn)中采取一定的穩(wěn)定化技術(shù)將是我們后續(xù)對篤斯越橘花青素的研究重點(diǎn)。