都盼盼，白宗利*，樂智勇,,3，許冬瑾

(1.康美(北京)藥物研究院有限公司，北京 102600；2.康美藥業(yè)股份有限公司，廣東 普寧 515300；3.廣東康美藥物研究院有限公司，廣東 廣州 510000)

陳皮為蕓香科植物橘(Citrusreticu1ataB1anco)及其栽培變種的干燥成熟果皮，藥材分為陳皮和廣陳皮，具有理氣健脾、燥濕化痰的功效，臨床用于脘腹脹滿、食少吐瀉、咳嗽痰多的治療。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，陳皮具有抗炎[1]、抗氧化[2]、抗心血管疾病[3]及抗癌[4-5]的作用，其活性成分主要為黃酮類化合物，如橙皮苷、川陳皮素、橘皮素等。

2015年版《中國藥典》規(guī)定陳皮的質(zhì)量控制指標(biāo)為薄層鑒別、水分和黃曲霉毒素檢查、橙皮苷含量測定，這能在一定程度上控制陳皮的質(zhì)量，但不甚全面。本研究對陳皮、新會陳皮藥材及陳皮飲片進(jìn)行研究，擬建立陳皮藥材和飲片黃酮類成分的特征圖譜，為其質(zhì)量全面評價的建立提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent1260型高效液相色譜儀(安捷倫科技中國有限公司)；XP-6型、XPE205型電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；KQ-500DE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；HWS-28型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)。

乙腈(色譜純、175163、賽默飛世爾科技中國有限公司)；甲醇(分析純、20180226、北京化工廠)；甲酸(分析純、20160414、天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司)；超純水(自制)。

橙皮苷對照品(110721-200613，96.1%，中國食品藥品檢定研究院)。收集各飲片生產(chǎn)企業(yè)陳皮飲片20批；收集亳州市場陳皮藥材20批，收集道地產(chǎn)區(qū)廣東新會陳皮40批，用于陳皮藥材和飲片特征圖譜研究。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Kromasil 100-2-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以乙腈為流動相A，以1%甲酸溶液為流動相B，按表1中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；柱溫為30℃；流速為1.0 mL/min；檢測波長為283 nm。理論塔板數(shù)按橙皮苷計算應(yīng)不低于2 000。

表1 梯度洗脫程序

2.2 對照品溶液制備

取橙皮苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.4 mg橙皮苷的溶液，即得。

2.3 供試品溶液制備

取本品粗粉約0.25 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密量取甲醇25 mL，超聲30 min，放冷，用甲醇中補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學(xué)驗證

按照《藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證指導(dǎo)原則》(《中國藥典》2015年版四部通則)的要求，對上述方法進(jìn)行方法學(xué)驗證。穩(wěn)定性實驗表明樣品在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好；精密度和重現(xiàn)性試驗測得各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD<5.0%，說明該方法重復(fù)性良好。

2.5 特征圖譜分析結(jié)果和相似度分析

2.5.1 陳皮藥材特征圖譜 20批陳皮藥材的供試品溶液按照“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果見圖1。

圖1 陳皮藥材特征圖譜

利用中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件，采用自動匹配法生成共有模式對照特征圖譜。結(jié)果見圖2。

圖2 陳皮藥材對照特征圖譜(S.橙皮苷)

數(shù)據(jù)表明，9個特征峰的相對保留時間分別為0.898(峰1)、1.000(峰2，S)、1.365(峰3)、1.521(峰4)、1.680(峰5)、1.952(峰6)、2.041(峰7)、2.112(峰8)、2.239(峰9)，相對保留時間RSD均小于3%，說明不同基源和不同批次的樣品有較多相同的成分；相對峰面積差異較大，RSD介于38.6%～85.4%之間，說明不同生長地區(qū)、不同環(huán)境與存儲條件的藥材含量差異較大。

2.5.2 新會陳皮藥材 共有特征圖譜40批新會陳皮的供試品溶液按上述確定條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果見圖3。

圖3 新會陳皮藥材特征圖譜

利用中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件，采用自動匹配法生成共有模式對照特征圖譜。結(jié)果見圖4。

數(shù)據(jù)表明，8個特征峰的相對保留時間分別為0.898(峰1)、1.000(峰2，S)、1.355(峰3)、1.671(峰4)、1.944(峰5)、2.036(峰6)、2.113(峰7)、2.231(峰8)，相對保留時間RSD均小于3%，說明不同廠家和不同批次的樣品有較多相同的成分；相對峰面積差異較大，RSD介于10.8%～26.0%之間，說明新會地區(qū)不同采收時間、不同栽培方式與不同批次的藥材含量有一定差異。

2.5.3 陳皮飲片 特征圖譜20批陳皮飲片的供試品溶液按上述確定條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果見圖5。

圖4 新會陳皮藥材對照特征圖譜(S.橙皮苷)

圖5 陳皮飲片特征圖譜

利用中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件，采用自動匹配法生成共有模式對照特征圖譜。結(jié)果見圖6。

圖6 陳皮飲片對照特征圖譜(S.橙皮苷)

數(shù)據(jù)表明，7個特征峰的相對保留時間分別為0.899(峰1)、1.000(峰2，S)、1.372(峰3)、1.527(峰4)、1.945(峰5)、2.045(峰6)、2.116(峰7)，相對保留時間RSD均<3%，說明不同廠家和不同批次的樣品有較多相同的成分；相對峰面積差異較大，RSD介于5.3%～14.1%之間，說明不同產(chǎn)地、不同炮制方法與不同批次對飲片含量有一定影響。

2.5.4 陳皮飲片與陳皮、新會陳皮藥材特征 圖譜之間的相關(guān)性 將陳皮飲片共有特征圖譜S1、陳皮藥材共有特征圖譜S2和新會陳皮藥材的共有特征圖譜S3進(jìn)行對比，驗證其是否有相關(guān)性。結(jié)果見圖7。

結(jié)果表明，陳皮藥材、新會陳皮藥材與陳皮飲片有7個共有峰，說明有較多相同的成分，新會陳皮與陳皮藥材相比少1個特征峰，陳皮飲片與陳皮藥材相比少2個特征峰，說明陳皮藥材與新會陳皮、陳皮飲片的特征圖譜存在差異。

圖7 陳皮藥材、新會陳皮藥材和陳皮飲片特征圖譜比較

3 討論

通過查閱文獻(xiàn)[6-7]，考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸溶液三種流動相組成，選用比甲醇洗脫能力強(qiáng)的乙腈為有機(jī)相，0.1%甲酸的加入可很好地改善峰形。選用超聲法[8-9]制備供試品溶液，對確定的方法進(jìn)行驗證，選定的方法峰形和分離度良好，理論塔板數(shù)按橙皮苷峰計算不低于2 000。

參照《中國藥典》2015年版一部陳皮項下含量測定方法，測定20批陳皮藥材、40批新會陳皮藥材和20批陳皮飲片的橙皮苷含量，結(jié)果顯示11批陳皮藥材符合《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)，合格率為55.0%；8批新會陳皮藥材達(dá)到《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)，合格率為20.0%；13批陳皮飲片符合《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)，合格率為65.0%。結(jié)果與已有的研究報道[10]較一致，說明單一成分的含量檢測不能總體反映陳皮質(zhì)量的優(yōu)劣。

本研究結(jié)果可為陳皮特征圖譜的建立提供參考。新會陳皮和陳皮藥材之間的差異性成分，陳皮藥材、陳皮飲片在炮制過程中的質(zhì)量傳遞與變化，尚需要進(jìn)一步研究。