段向蘭，王 洋，尚 軍

(青海師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，青海 西寧 810008)

橢圓葉花錨(HaleniaeliPticaD.Don)藏名甲地然果，屬龍膽科花錨，根據(jù)記載，該藥以全草入藥，味苦、性寒，具有清熱利濕、平肝利膽的功效，可用于急性黃疸性肝炎、膽囊炎、頭暈頭痛、牙痛的治療[1]，也可用于治療外傷感染、脈熱[2]等疾病，是傳統(tǒng)藏醫(yī)臨床上治療肝膽疾病的常用藥物之一?；ㄥ^的主要化學(xué)成分為呫噸酮及其苷、裂環(huán)烯醚萜類、三萜類及黃酮苷等化合物[3-4]，還含有齊墩果酸。已有大量研究證實(shí)齊墩果酸具有清熱、消炎、抑菌、保肝、護(hù)肝、增加白細(xì)胞、降低轉(zhuǎn)氨酶等作用[5]，是橢圓葉花錨的主要藥效物質(zhì)之一。

肝臟是人體內(nèi)最大、功能最多的實(shí)質(zhì)性腺體器官，被喻為“人體最大的化工廠”。主要參與體內(nèi)消化、代謝、排泄、解毒和免疫的過程，是具有重要而復(fù)雜代謝功能的器官[6]。肝損傷主要包含病理性、化學(xué)性及外傷性損傷。病理性的肝損傷主要是由各種病毒病菌引發(fā)，可表現(xiàn)為肝纖維化、肝硬化、肝細(xì)胞壞死等其他癥狀?；瘜W(xué)性肝損傷主要是指使用化學(xué)物質(zhì)過多或機(jī)體過敏等原因所導(dǎo)致的體內(nèi)環(huán)境的紊亂。外傷性肝損傷是臨床上常見的急重癥之一，患者的肝實(shí)質(zhì)往往受到較嚴(yán)重的損傷，且同時(shí)伴有不同程度的肝內(nèi)外血管受損，往往會(huì)導(dǎo)致患者出現(xiàn)腹腔內(nèi)積血，引發(fā)失血性休克，對(duì)其生命安全造成嚴(yán)重威脅[7]。目前在臨床上最常見的肝損傷案例以病毒性、化學(xué)性為主，外傷性肝損傷較為少見。近年來肝病發(fā)病率逐年上升[8]，已嚴(yán)重危害人類的身體健康。近現(xiàn)代藥理研究表明，花錨及復(fù)方花錨具有調(diào)節(jié)體液免疫的作用，且全草的氯仿提取部分具有抗阿米巴作用，對(duì)治療肝損傷有一定的療效[9]。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

KM小鼠50只，體重(20±2)g，雌雄各半，購于蘭州大學(xué)，許可證：scxk(甘)2013-0002。

1.2 試劑

四氯化碳(CCl4)溶液；玉米油(秦皇島金海食品工業(yè)有限公司)；聯(lián)苯雙酯滴丸(浙江萬邦藥業(yè)股份有限公司)；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)測(cè)定試劑盒、天門冬氨酸轉(zhuǎn)移酶(AST)測(cè)定試劑盒、丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備

奧豪斯AdventurerTM電子天平；粉碎機(jī)；萬用電爐；自動(dòng)攪拌器；R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；華普達(dá)數(shù)顯恒溫水浴鍋；電熱鼓風(fēng)干燥箱；XTP-500型高速多功能搖擺粉碎機(jī)；Bio-Rad XMARK酶標(biāo)儀；TD3低速離心機(jī)；海爾冰箱；微量加樣器；微量振蕩器。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 橢圓葉花錨醇/水提取物制備

取橢圓葉花錨1.5 kg，全草粉碎過100目篩，將粉碎物與75%乙醇/蒸餾水1∶6混合，浸泡3 h后煎煮3次，每次微沸1 h，取上清液合并濃縮，水浴鍋90 ℃條件下濃縮至固體，干燥后研磨成粉并配制成所需濃度的溶液，置于4 ℃冰箱待用。

2.2 四氯化碳(CCl4)致小鼠急性肝損傷模型制備

在參考文獻(xiàn)[10-11]的基礎(chǔ)上，觀察KM小鼠處于正常狀態(tài)，適應(yīng)性飼養(yǎng)7天后。隨機(jī)分成8組，雌雄各半，每組80只。分別為空白對(duì)照組，聯(lián)苯雙酯陽性對(duì)照組(0.2 g/kg)，橢圓葉花錨乙醇提取物和水提取物低(0.5 g/kg)、中(2.5 g/kg)、高劑量組(12.5 g/kg)。連續(xù)給藥7天，末次給藥1 h后，空白對(duì)照組小鼠腹腔注射等體積的橄欖油(0.2 mL/10g)，其他組均注射CCl4(0.1%，0.2 mL/10g)，18 h后對(duì)小鼠摘眼球取血，3 000 r·min-1離心10 min取上血清，采用試劑盒測(cè)定相關(guān)指標(biāo)，進(jìn)行比較分析。

3 結(jié)果

3.1 橢圓葉花錨對(duì)肝損傷小鼠體內(nèi)血清中ALT、AST含量的影響

末次給藥12 h后摘眼球取血，離心后測(cè)定血清中ALT、AST含量。結(jié)果如表1所示。與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠血清中ALT、AST含量顯著升高(P<0.01)，造模成功。與模型組比較，橢圓葉花錨醇提物和水提物的3個(gè)劑量均對(duì)小鼠體內(nèi)ALT、AST水平有影響。其中低、中、高劑量醇提物使小鼠血清中ALT含量分別減少了27.09%、29.11%和31.16%。低、中、高劑量水提物小鼠血清中ALT含量分別減少了23.76%、27.42%和30.29%。高、中劑量橢圓葉花錨醇提物和水提物對(duì)小鼠ALT、AST含量影響顯著，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

此外，橢圓葉花錨提取物對(duì)小鼠血清中AST含量也有一定影響，且醇提物影響最為明顯。低、中、高劑量醇提物使小鼠血清中AST含量分別減少了24.81%、35.66%和39.69%。低、中、高劑量水提物使小鼠血清中AST含量分別減少24.93%、35.37%和37.66%。除橢圓葉花錨水提物低劑量組效果不顯著外，其他藥物組對(duì)小鼠體內(nèi)AST的影響均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 橢圓葉花錨對(duì)CCl4致肝損傷小鼠ALT、AST活性的影響

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.2 橢圓葉花錨對(duì)肝損傷小鼠體內(nèi)血清中MDA的影響

如表2所示，模型組小鼠血清中MDA含量較空白組明顯升高，各藥物組均能降低小鼠體內(nèi)MDA含量。其中，低、中、高劑量橢圓葉花錨醇提物使小鼠MDA含量分別減少了21.49%、33.09%和34.64%，與模型組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。除水提物低劑量組外，中、高劑量橢圓葉花錨水提物組小鼠MDA含量分別減少了23.48%和37.24%，與模型組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中高劑量橢圓葉花錨醇提物和水提物對(duì)小鼠血清中MDA的影響最為顯著(P<0.01)。

表2 橢圓葉花錨對(duì)CCl4致肝損傷小鼠血清MDA含量的影響

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

4 討論

四氯化碳誘導(dǎo)的肝損傷模型包括急性肝損傷和慢性肝損傷兩種，該方法也可用于多種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝損傷模型的建立。CCl4致肝損傷經(jīng)典模型通常用于評(píng)價(jià)藥物對(duì)肝損傷是否有保護(hù)作用[12]。ALT和AST主要分布于肝臟，是診斷肝臟疾病最常用的酶，當(dāng)肝臟受到一定損傷時(shí)，細(xì)胞膜的通透性增加，使ALT、AST外泄至血清。MDA是自由基引起的脂質(zhì)過氧化過程中生成的一種醛類物質(zhì)，MDA水平升高，SOD活性降低，可引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞損傷甚至細(xì)胞凋亡，因此可根據(jù)小鼠血清中ALT、AST和MDA含量的變化，以判斷橢圓葉花錨是否具有保肝降酶作用[13]。

本實(shí)驗(yàn)建立CCl4小鼠急性肝損傷模型，將KM小鼠分組后分別注射高、中、低劑量橢圓葉花錨醇提取物和水提取物，通過檢測(cè)KM實(shí)驗(yàn)小鼠血清中的ALT、AST和MDA含量，討論各給藥組對(duì)小鼠化學(xué)性肝損傷的保護(hù)作用。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，首先對(duì)模型組與空白組小鼠的指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，表明此次肝損傷造模成功。其次，橢圓葉花錨高、中、低劑量醇提物和水提物均可使CCl4誘導(dǎo)的肝損傷小鼠血清中ALT、AST及MDA含量降低，且高劑量組效果最為顯著(P<0.01)，說明橢圓葉花錨具有一定的保肝降酶的作用。橢圓葉花錨水提物和醇提物的保肝作用在設(shè)定濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)出隨劑量增大而作用增強(qiáng)的效果，且醇提物較水提物的保肝作用略為明顯。因此，今后的研究可進(jìn)一步探索橢圓葉花錨的保肝作用，為臨床藏藥的開發(fā)使用以及藥物篩選提供參考。