梁?jiǎn)谭?，廖小林，吳洪?

(1.柳州市工人醫(yī)院 藥學(xué)部，廣西 柳州 545005；2.柳州市中醫(yī)院 骨科，廣西 柳州 545001)

莪術(shù)醇來(lái)源于姜科植物莪術(shù)的根莖以及郁金的根莖。莪術(shù)具有行氣破血、消積止痛的功效，主治血?dú)庑耐?、飲食積滯、脘腹脹痛、血滯經(jīng)閉、痛經(jīng)、瘕瘤痞塊、跌打損傷[1]。大量實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，莪術(shù)中的莪術(shù)醇能抑制腫瘤細(xì)胞增殖，發(fā)揮較好的抗腫瘤作用[2]。B淋巴細(xì)胞瘤-2基因簡(jiǎn)稱bcl-2(B-cell lymphoma-2)，是細(xì)胞凋亡研究中最受重視的癌基因之一。Bcl-2可與Bcl-2家族的Bax形成同源的蛋白二聚體，而特定的蛋白二聚體則可作為在細(xì)胞死亡信號(hào)通路上的分子開關(guān)。羅吉等[3]研究發(fā)現(xiàn)，抑制結(jié)腸癌細(xì)胞可能通過(guò)改變BCL-2、Bax水平來(lái)實(shí)現(xiàn)，也可通過(guò)影響Caspase家族蛋白實(shí)現(xiàn)抗腫瘤作用[4]。故本實(shí)驗(yàn)以莪術(shù)醇為治療藥物，順鉑為陽(yáng)性藥，研究其對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116的影響以及相關(guān)作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與試劑

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

生物安全柜(BSC-1000IIA2，蘇凈安泰)；低溫高速離心機(jī)(Eppendorf 5811，德國(guó))；二氧化碳培養(yǎng)箱 (SHELDON3552-2，美國(guó))；倒置顯微鏡(OLYMPUS IX71-22FL/PH，日本)；高壓蒸汽滅菌鍋(panisonic mLS-3751L-pc，日本)；恒溫干燥箱(ZBY149-83，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(Thermo Scientific 1510，美國(guó))；超純水儀(CD-UPW-IV，成都越純科技有限公司)；冰箱(博世冰箱BCD-254，德國(guó))；超低溫冰箱(Thermo Scientific Forma 900，美國(guó))；恒溫水浴鍋(ZSXH-618，上海智城分析儀器制造有限公司)；液氮罐(ThermoFisherBio，美國(guó))。

1.2 細(xì)胞株

人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116購(gòu)自于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。

1.3 藥品與試劑

莪術(shù)醇(批號(hào)：20180525，純度≥98.0%，梯希愛(ài)(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司)； RPMI 1640培養(yǎng)液(廣州潔特生物過(guò)濾股份有限公司，批號(hào)：180301-377)； Hank’s Balanced Salt Mixture(索萊寶，批號(hào)20180429)；胰酶(Gibco，美國(guó))；青鏈霉素混合液(索萊寶，批號(hào)20180512)；胎牛血清(四季青，批號(hào)20180518)；CCK8(日本同仁)；BAX(批號(hào)AA368876)、Bcl-2(批號(hào)AA656642)、Caspase9(批號(hào)AA126876)兔抗人單克隆抗體、二抗為抗兔(批號(hào)AA126544)，均購(gòu)自bioworld公司。FDA染色劑(Sigma公司，批號(hào)：F7378)；順鉑注射液(山東齊魯制藥有限公司，批號(hào)：6A002A88)；BCA試劑盒、ECL發(fā)光液均購(gòu)自上海碧云天有限公司。

2 方法

2.1 HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞的培養(yǎng)

用長(zhǎng)鑷子從液氮罐里取出裝有HCT116的凍存管，在37 ℃水浴鍋里，搖晃1 min，使之全部融化，然后加入一定量的含10%的血清和1%青鏈霉素混合液的高糖培養(yǎng)基(完全培養(yǎng)基)，1 000 r/5 min離心，棄去上清液，加入完全培養(yǎng)基，吹打混勻后移至培養(yǎng)瓶，在37 ℃，5%CO2無(wú)菌培養(yǎng)箱里培養(yǎng)，一般4 h細(xì)胞完全貼壁，48 h后傳代。丟棄細(xì)胞培養(yǎng)廢液，用Hank's清洗兩遍，注意動(dòng)作輕柔，防止洗掉貼壁細(xì)胞，加入適量胰酶并在顯微鏡下觀察，等到細(xì)胞開始變得圓潤(rùn)并且開始脫落，加入完全培養(yǎng)基終止消化，1 000 r/5 min離心，加入完全培養(yǎng)液分裝至培養(yǎng)瓶。一般穩(wěn)定傳2～3代后，即可用細(xì)胞開展實(shí)驗(yàn)。

2.2 莪術(shù)醇對(duì)HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)細(xì)胞，按照8×103個(gè)細(xì)胞接板至96孔板，每孔加100 L，分為空白對(duì)照組、陽(yáng)性藥組、莪術(shù)醇高、中、低組，6個(gè)復(fù)孔。空白組加不完全培養(yǎng)液，陽(yáng)性藥組加含有5 μmol/L 順鉑的不完全培養(yǎng)液，給藥組分別加100、50、25 μg/mL的莪術(shù)醇，37 ℃，5%CO2孵育24 h，分別加入以上對(duì)應(yīng)組，24 h后加入10% cck8，1h后在450 nm測(cè)得OD值。按照以下公式計(jì)算出存活率，其中細(xì)胞存活率=(劑量組OD值-對(duì)照組OD值)/對(duì)照組OD值× 100%。

2.3 不同劑量的莪術(shù)醇對(duì)HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞的FDA染色

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)細(xì)胞，按照每孔4×106個(gè)細(xì)胞接板至6孔板，每孔加2 mL，分為對(duì)照組，陽(yáng)性藥組，10、25、100 μg/mL 莪術(shù)醇劑量組，共5個(gè)組，3個(gè)復(fù)孔。37℃，5%CO2孵育24 h，對(duì)照組只加不完全培養(yǎng)液，3 h后，棄去所有培養(yǎng)液，用Hank’s輕柔清洗兩遍，給藥組分別給予對(duì)應(yīng)劑量藥物，F(xiàn)DA染色后，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)學(xué)特征并拍照。

2.4 Western Blot法檢測(cè)不同劑量莪術(shù)醇干預(yù)HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞BCL-2、BAX、Caspase9蛋白表達(dá)

2.4.1 細(xì)胞處理 細(xì)胞穩(wěn)定傳代后，加完全培養(yǎng)液，細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶，空白組不完全培養(yǎng)液，陽(yáng)性藥組和莪術(shù)醇組分別用不完全培養(yǎng)液稀釋藥物。劑量按照“2.2”項(xiàng)下方法設(shè)計(jì)。干預(yù)24 h后，棄去培養(yǎng)液，以Hank’s輕柔清洗兩遍，胰酶消化后，離心收集細(xì)胞。每管加入1 mL裂解液，充分震蕩后，冰水里裂解30 min，取上清液轉(zhuǎn)移至新的EP管中。

2.4.2 蛋白含量測(cè)定 取5 mg/mL BSA(牛血清白蛋白)標(biāo)準(zhǔn)品10 μL用去離子水稀釋至100 μL，使終濃度為0.5 mg/mL。分別取標(biāo)準(zhǔn)品0、1、2、4、8、12、16、20 μL加至96孔板的標(biāo)準(zhǔn)品孔中，加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液(去離子水或PBS緩沖液)補(bǔ)足至20 μL，此時(shí)BSA標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為0、25、50、100、200、300、400、500 μg/μL。加適當(dāng)體積樣品至96孔板的樣品孔中，若樣品不足20 μL，需加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液(去離子水)補(bǔ)足至20 μL，記錄待測(cè)孔所加樣品的體積。加200 μL顯色液，孵育15 min，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)，計(jì)算蛋白含量并確定最終上樣量。

2.4.3 樣品處理 使用5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，按照樣本∶緩沖液=4∶1混勻，沸水煮20 min，放室溫后轉(zhuǎn)移到-20℃冰箱保存。

2.4.4 制膠 本實(shí)驗(yàn)選用12%壓縮膠，5%分離膠。

2.4.5 上樣與電泳 將樣本拿出恢復(fù)到室溫后，震蕩混勻后，將蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)即可。 本實(shí)驗(yàn)采用SDS-PAGE過(guò)程恒壓的方式，通常電壓設(shè)置為100 V，1 h。

2.4.6 轉(zhuǎn)膜 使用0.22 μm的PVDF膜，設(shè)定轉(zhuǎn)膜電壓為110 V，轉(zhuǎn)膜時(shí)間為110 min。在轉(zhuǎn)膜過(guò)程中，特別是高電流快速轉(zhuǎn)膜時(shí)，通常會(huì)有非常嚴(yán)重的發(fā)熱現(xiàn)象，故將轉(zhuǎn)膜槽放置在冰浴中。

2.4.7 封閉 轉(zhuǎn)膜完畢后，立即將蛋白膜放置到預(yù)先準(zhǔn)備好的Western洗滌液(1X TBS-T溶液)中，漂洗1～2 min，以洗去膜上的轉(zhuǎn)膜液。轉(zhuǎn)膜完畢后應(yīng)特別注意膜的保濕，避免膜干燥，否則極易產(chǎn)生較高的背景。用滴管等吸盡洗滌液，加入Western封閉液(5%脫脂奶粉)，在搖床上緩慢搖動(dòng)，37 ℃封閉1 h以上，室溫封閉2 h以上。對(duì)于一些背景較高的抗體，可以4 ℃封閉過(guò)夜。

2.4.8 一抗孵育 參考一抗的說(shuō)明書，按照適當(dāng)比例用Western一抗稀釋液(1X TBS-T溶液)稀釋一抗。封閉后，棄去封閉液，1X TBS-T溶液洗膜，洗去封閉液即可。

2.4.9 二抗孵育 加入稀釋好的二抗，室溫或4 ℃在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)孵育2 h，37 ℃下1 h。 回收二抗，加入1X TBS-T溶液，在搖床上緩慢搖動(dòng)洗滌5～10 min。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液洗滌5～10 min。共洗滌3次。若結(jié)果背景較高可以適當(dāng)延長(zhǎng)洗滌時(shí)間并增加洗滌次數(shù)。

2.4.10 蛋白檢測(cè) 本步驟稱為曝光、洗片、顯色或顯影。采用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯色，將孵育二抗并清洗完畢的PVDF膜置于天能5300凝膠成像系統(tǒng)內(nèi)。取等體積的發(fā)光液A和發(fā)光液B混勻，均勻撒在PVDF膜上，運(yùn)行凝膠成像系統(tǒng)的軟件，選擇化學(xué)發(fā)光，設(shè)置曝光時(shí)間，拍照并保存。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，用t檢驗(yàn)分析各個(gè)組之間的差異，求得標(biāo)準(zhǔn)偏差表示其浮動(dòng)范圍，求得P值，按照P<0.05標(biāo)準(zhǔn)判定組間有差異。

3 結(jié)果

3.1 莪術(shù)醇對(duì)HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響

不同劑量莪術(shù)醇對(duì)HCT116細(xì)胞干預(yù)24 h后，對(duì)其抑制率有不同的影響。干預(yù)濃度升高，對(duì)細(xì)胞的抑制率也升高。其中陽(yáng)性藥組細(xì)胞存活率為22.5%，高、中、低莪術(shù)醇劑量組細(xì)胞存活率分別為35.4%、58.2%、83.1%。 具體見表1。

表1 不同組別結(jié)腸癌細(xì)胞活性比較

3.2 莪術(shù)醇對(duì)HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞BCL-2、BAX、CasPase9蛋白表達(dá)的影響

圖1A為各組蛋白電泳圖，B、C、D分別為BAX、CasPase9、BCL-2蛋白表達(dá)水平柱狀圖。與空白組相比，陽(yáng)性藥組細(xì)胞Bax、casPase9表達(dá)水平顯著提高(P<0.01)，Bcl-2表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)，莪術(shù)醇高、低劑量組細(xì)胞BAX水平顯著提高(P<0.05)，莪術(shù)醇高、中劑量組細(xì)胞casPase9水平顯著提高(P<0.01)，Bcl-2水平顯著降低(P<0.01)。見表2。

圖1 不同組別 BAX、Caspase9、BCL-2蛋白表達(dá)水平

表2 不同組別結(jié)腸癌細(xì)胞 BAX、Caspase9、BCL-2蛋白表達(dá)水平比較

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.3 不同組別結(jié)腸癌細(xì)胞FDA染色

空白組細(xì)胞生長(zhǎng)密集，陽(yáng)性藥物組細(xì)胞稀疏，效高、中、低劑量莪術(shù)醇組細(xì)胞分別呈密集到稀疏趨勢(shì)。具體見圖2。

圖2 不同組別HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞FDA染色

4 討論

結(jié)腸癌是常見的發(fā)生于結(jié)腸部位的消化道惡性腫瘤，好發(fā)于直腸與乙狀結(jié)腸交界處，以40～50歲年齡段發(fā)病率最高，男女比例為2～3∶1，發(fā)病率為胃腸道腫瘤的第3位。結(jié)腸癌主要為腺癌、黏液腺癌、未分化癌，大體形態(tài)呈息肉狀、潰瘍型等。結(jié)腸癌可沿腸壁環(huán)行發(fā)展，沿腸管縱徑上下蔓延或向腸壁深層浸潤(rùn)，除經(jīng)淋巴管、血流轉(zhuǎn)移和局部侵犯外，還可向腹腔內(nèi)種植或沿縫線、切口面擴(kuò)散轉(zhuǎn)移。

研究發(fā)現(xiàn)，莪術(shù)醇能明顯抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖，并且可能對(duì)凋亡蛋白有一定影響。細(xì)胞凋亡是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主的有序死亡。細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死不同，細(xì)胞凋亡不是一件被動(dòng)的過(guò)程，而是主動(dòng)過(guò)程，其涉及一系列基因的激活、表達(dá)以及調(diào)控等作用。細(xì)胞凋亡并不是病理?xiàng)l件下自體損傷的一種現(xiàn)象，而是為更好地適應(yīng)生存環(huán)境而主動(dòng)爭(zhēng)取的一種死亡過(guò)程。Bcl-2家族、caspase家族與細(xì)胞凋亡密不可分。

本研究結(jié)果表明，莪術(shù)醇能提高結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116凋亡蛋白BAX、Caspase9的表達(dá)，降低抗凋亡蛋白BCL-2的表達(dá)[5-6]，且在CCK8細(xì)胞活性檢測(cè)以及FDA染色中表現(xiàn)出較好的抑制作用及形態(tài)學(xué)變化。綜上所述，莪術(shù)醇對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116有一定抑制作用，可能是通過(guò)影響凋亡蛋白的表達(dá)而發(fā)揮抗癌作用。