宋俊杰，范軍朝，王 瑩，鄭孝振

(河南大學第一附屬醫(yī)院，河南 開封 475000)

環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)不僅是細胞毒性化療藥物，同時屬于烷化劑類免疫抑制劑，可破壞DNA結構，阻斷其復制，從而導致細胞死亡。因此，環(huán)磷酰胺可作為廣譜抗腫瘤藥物，或治療自身免疫性疾病以及器官移植后的免疫排斥反應等[1]，也可作為制造免疫低下模型的工具藥。山藥多糖是山藥重要的活性物質，具有多種藥理作用，如調節(jié)免疫、抗氧化、延緩衰老、抗腫瘤、降血糖、保護肝臟、促進腎臟再生修復、改善消化功能等[2]。本文旨在探究環(huán)磷酰胺造模后機體脾臟組織的變化，以及不同劑量山藥多糖對小鼠脾臟的影響，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與動物

動物：SPF級KM小鼠，雄性，32只，體質量18～22 g，購自河南省動物實驗中心，合格證：SCXK(豫)2010-0002。動物飼料20 kg購自河南省動物實驗中心。所有實驗動物飼養(yǎng)于河南大學第一附屬醫(yī)院腫瘤分子免疫實驗室，環(huán)境清潔，溫度17～23 ℃，相對濕度45%～55%，光照隨晝夜變化，自由飲水、攝食。

材料：注射用環(huán)磷酰胺(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)；山藥多糖(純度99%，楊凌慈緣生物技術有限公司)；戊巴比妥鈉(規(guī)格：5 g，北京普博斯生物科技有限公司)；注射用生理鹽水。

1.2 實驗方法

小鼠適應性飼養(yǎng)1周后，隨機將小鼠分為正常對照組(C組，n=8)，環(huán)磷酰胺+鹽水組(N組，n=8)，環(huán)磷酰胺+山藥多糖中劑量組(M組，n=8)，環(huán)磷酰胺+山藥多糖高劑量組(H組，n=8)。山藥多糖中劑量為150 mg/kg，高劑量為250 mg/kg。預先腹腔注射環(huán)磷酰胺80 mg/kg，5天，建立小鼠免疫低下模型，5天后再分別給予不同劑量山藥多糖處理灌胃每天1次，持續(xù)14天。于第15天采集血液和器官標本，以50 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，尾部橫切后足量采集尾靜脈血，全部采集完成后立即行外周血檢測。于小鼠腹部正中縱行切開，充分暴露腹腔內臟器，分別辨認并取出完整的脾臟和胸腺，4℃生理鹽水清洗干凈后拭去水分，稱重。分別取部分脾臟置于4%多聚甲醛溶液中固定后待病理學觀察。

1.3 觀察檢測指標

①體重：每次給藥前稱重，觀察小鼠體態(tài)改變，稱取小鼠體重并記錄；②脾臟指數：脾臟指數=脾重/體重(%)；③脾組織病理學：將固定后標本，經脫水、透明、浸蠟、包埋、染色、封片等步驟后于顯微鏡下觀察肝臟和脾臟微結構的變化；④血細胞計數：應用血細胞分析儀檢測小鼠外周血中紅白細胞計數。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 體重

注射環(huán)磷酰胺后，與N組相比，其他各組小鼠體重無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；與N組相比，C組小鼠在T9～T15期間體重明顯增加。見圖1。

注： 與N組相比，*P<0.05。

2.2 脾臟指數

與C組相比，N組小鼠肝臟指數明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與N組相比，M組和H組小鼠肝臟指數增加，且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；M組和H組小鼠脾臟指數比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組小鼠脾臟指數比較

注：與C組相比，*P<0.05；與N組相比，#P<0.05。

2.3 脾臟組織病理學變化

C組：正常脾臟組織，紅髓和白髓可分辨；N組：脾小節(jié)結構不清，增生明顯，紅髓和白髓分辨不清；M組：部分脾小節(jié)結構不清，輕度增生，可分辨出紅、白髓；H組：可分辨出紅、白髓，脾小節(jié)結構基本正常。見圖2。

圖2 脾臟組織病理學改變(×40)

2.4 血細胞計數變化

與C組相比，N組小鼠白細胞計數明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與N組相比，M組和H組小鼠白細胞計數明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；M組和H組小鼠白細胞計數比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖3。

注：與E組相比，*P<0.05；與M組相比，#P<0.05。

3 討論

注射環(huán)磷酰胺后，各組小鼠體重均有所下降。但與N組相比，正常對照組小鼠在第5天后體重增加，且在第9～15天差異有統(tǒng)計學意義。由此可見，注射環(huán)磷酰胺能使小鼠體重下降，但應用山藥多糖后，體重稍有改善。有文獻[3]顯示，環(huán)磷酰胺組小鼠體重與空白對照組相比，多數體重下降，但差異不具有顯著統(tǒng)計學意義。徐光翠等[4]研究表明，與鎘染毒模型組相比，山藥多糖劑量組體重隨劑量(50，200，500 mg/kg)的增加而增加。與此研究中山藥多糖劑量相比，本研究的劑量相對較小。

胸腺和脾臟是機體重要的免疫器官[5]。脾的重要功能是濾過，可通過巨噬細胞清除衰老的紅細胞或通過T細胞對其他抗原產生應答。故而，脾大(體積和質量的增加)或脾指數增長在一定程度上反映了脾臟結構及功能的變化[6-7]。本研究發(fā)現，注射CTX后，N組小鼠脾臟指數明顯降低，與C組相比差異具有統(tǒng)計學意義；M組和H組小鼠脾臟指數明顯增加，與N組相比差異具有統(tǒng)計學意義。袁羿[8]在實驗研究中發(fā)現，BaLb/C雄性小鼠經連續(xù)腹腔注射CTX 80 mg/kg 3天后，小鼠脾臟指數明顯下降。另有研究[9]發(fā)現，環(huán)磷酰胺組免疫器官指數(脾臟指數、胸腺指數)均明顯低于空白對照組，差異具有統(tǒng)計學意義。而在鹽酸林可霉素致腸炎模型中也發(fā)現，與正常對照組相比，納米山藥多糖組免疫器官指數顯著提高[10]。王德青等[11]發(fā)現，相較于空白對照組，山藥多糖組可明顯提高脾臟指數。并且隨著山藥多糖劑量的增加，脾臟的增重效果更明顯，脾臟指數不斷上升[12]。由此可見，注射CTX降低了小鼠的脾臟指數，而山藥多糖可以提高CTX所致的脾臟指數低下。

脾在胚胎早期具有造血功能，成年后仍可在某些病理情況下發(fā)揮造血功能，但對于機體免疫系統(tǒng)而言，脾臟在免疫應答方面發(fā)揮巨大作用，它是對進入血液的抗原性物質產生免疫應答的重要部位，無論是體液免疫或是細胞免疫均可導致脾結構的變化。本研究發(fā)現：C組脾臟組織正常，紅髓和白髓可分辨、結構清晰；N組脾小節(jié)結構不清，增生明顯，紅髓和白髓分辨不清；M組部分脾小節(jié)結構不清，輕度增生，可分辨出紅、白髓；H組可分辨出紅、白髓，脾小節(jié)結構基本正常。包匯慧等[13]在CTX對大鼠脾細胞抑制作用的研究中也發(fā)現，在20 mg/kg CTX灌胃給藥的大鼠中組織檢查發(fā)現脾內結構破壞，甚至出現纖維增生。有文獻報道[9]稱：“空白對照組脾臟被膜較厚，并伸入實質形成小梁；脾臟實質由紅髓和白髓組成，其界限分明，白髓內淋巴細胞較為密集”“CTX組脾臟組織結構雜亂，紅髓與白髓界限不清，白髓結構散亂，脾小結明顯變小，淋巴細胞較為稀疏?！贝隧椊Y果表明，CTX灌胃造成了脾臟病理學損傷，中劑量和高劑量的山藥多糖可改善CTX所致的脾臟組織病理學損傷，且以高劑量較為明顯。

白細胞是人體血液中非常重要的有吞噬功能的細胞，其可以吞噬異物并產生抗體，是人體防御系統(tǒng)的重要防線。本研究發(fā)現，與C組相比，N組小鼠白細胞計數明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與N組相比，M組和H組小鼠白細胞計數明顯升高(P<0.05)。有研究表明，使用CTX以后，雄鼠外周血液系統(tǒng)中白細胞總數有所下降[14]。在加味四君子湯對CTX(80 mg/kg，連續(xù)3天)致免疫低下小鼠的免疫調節(jié)研究中發(fā)現，第7天后檢查白細胞數目明顯減少，在第11天白細胞數目明顯升高[15]。本研究也證明了CTX可降低血液中白細胞計數，并且同時表明低劑量和高劑量山藥多糖灌胃可以提高CTX所致的白細胞低下。由此推測，山藥多糖對臨床腫瘤患者應用CTX化療后所致的白細胞低下也有相應的提升作用，但這一推測有待進一步研究證實。