朱十偉,薛立英,高 麗,秦雪梅,杜冠華,,周玉枝*

(1山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心,太原 030006;2山西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院;3中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院、北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所;*通訊作者,E-mail:zhouyuzhi@sxu.edu.cn)

衰老是機(jī)體各器官功能退行性下降的必然過(guò)程。隨著年齡的增長(zhǎng),機(jī)體對(duì)抗外界壓力的能力降低,致使與衰老相關(guān)的疾病發(fā)生率普遍升高,如:阿爾茨海默病、帕金森癥、心腦血管疾病、糖尿病和癌癥等。中藥黃芩為唇形科植物,以根入藥。黃芩中含有黃酮類、揮發(fā)油、萜類和多糖等多種化學(xué)成分[1],其中黃酮類化合物和多糖是黃芩發(fā)揮藥理作用的主要成分。本課題組前期研究報(bào)道了黃芩乙醇提取物能夠改善D-gal致大鼠衰老模型中模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能,延緩果蠅衰老[2,3]。另有研究報(bào)道,黃芩水提物能夠提高快速老化小鼠P/8的抗氧化能力和免疫功能[4];黃芩莖葉總黃酮能夠提高鋁毒衰老模型小鼠的記憶能力和修復(fù)自由基功能異常[5]。另外,黃芩中的單體成分黃芩苷和黃芩素也具有提高衰老大鼠學(xué)習(xí)記憶的能力[6,7]。雖然黃芩粗提物和某些單體已被證實(shí)具有抗衰老活性,但目前黃芩中的抗衰老有效部位尚不明確,黃芩抗衰老有效部位的研究將為探究其抗衰老物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供依據(jù)。本研究嘗試將黃芩醇提物分離,富集不同部位成分,進(jìn)而對(duì)各部位成分進(jìn)行抗衰老活性評(píng)價(jià),為后期抗衰老活性成分的篩選提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

野生型黑腹果蠅W1118品系(山西大學(xué)應(yīng)用生物學(xué)研究所)。

1.2 黃芩及主要試劑

黃芩(山西省晉城市陵川縣),經(jīng)山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心主任秦雪梅教授鑒定為《中國(guó)藥典》2015版所收錄的正品黃芩(Scutellaria baicalensis Georgi);HPD100大孔吸附樹(shù)脂購(gòu)自天津浩聚樹(shù)脂科技有限公司;分析純的無(wú)水乙醇、蔗糖和丙酸均購(gòu)自天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司;標(biāo)準(zhǔn)品:黃芩苷(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%),漢黃芩苷(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%),黃芩素(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)和漢黃芩素(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所;玉米粉(市售);瓊脂(分析純)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;酵母粉(食品級(jí))購(gòu)自安琪酵母股份有限公司。

1.3 主要儀器

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,德國(guó)艾卡集團(tuán);冷凍干燥機(jī),寧波新芝生物科技股份有限公司;Agilent 1260 Infinity高效液相色譜儀,美國(guó)安捷倫公司;Thermo BDS Hypersil C18(5 μm,4.6 mm×250 mm)高效液相色譜柱,美國(guó)賽默飛公司;果蠅培養(yǎng)管,北京中創(chuàng)宏達(dá)科技有限公司;MGC-350HP-2人工氣候箱,上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.4 黃芩不同分離部位的制備

1.4.1 黃芩醇提物的制備 本實(shí)驗(yàn)采用前期課題組建立的黃芩提取優(yōu)化工藝[8]。將黃芩粉碎得中粉,加入10倍量的70%乙醇,80 ℃回流提取1.5 h,過(guò)濾,重復(fù)提取2次,合并濾液,減壓濃縮,冷凍干燥,得黃芩醇提物干樣品。

1.4.2 大孔樹(shù)脂預(yù)處理 95%乙醇浸泡HPD100大孔吸附樹(shù)脂24 h。采用濕法裝柱,90%乙醇沖洗色譜柱,直至流出液與水1 ∶5混合后無(wú)渾濁,最后水洗至無(wú)醇味。

1.4.3 洗脫 將1.4.1得到的黃芩醇提物干樣品的水溶液加入大孔樹(shù)脂柱,分別以水、50%乙醇和95%乙醇作為洗脫溶劑,以流速3 BV/h進(jìn)行洗脫,每個(gè)梯度收集3 BV。

1.4.4 濃縮與干燥 將1.4.2得到的洗脫液進(jìn)行減壓濃縮后,分別將濃縮液冷凍干燥得到水、50%乙醇和95%乙醇洗脫部位干燥產(chǎn)物,計(jì)算出膏率,出膏率=各部位產(chǎn)量(g)/干樣品上樣量(g)×100%。

1.5 黃芩不同洗脫部位主要化學(xué)成分定性分析

1.5.1 色譜條件 色譜柱:Thermo BDS Hypersil C18(5 μm,4.6 mm×250 mm)高效液相色譜柱;檢測(cè)器:紫外檢測(cè)器;流動(dòng)相:以0.4%的磷酸水溶液為流動(dòng)相A,以甲醇為流動(dòng)相B,在波長(zhǎng)277 nm處按表1的條件進(jìn)行梯度洗脫[8]。

表1梯度洗脫條件

Table1Gradientelutionconditions

時(shí)間(min)流動(dòng)相A(%)流動(dòng)相B(%)流速(ml/min)05347110257511501001200100122534712753471

1.5.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取對(duì)照品黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素適量,加甲醇分別制成每1 ml含黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素各62.3,224,39.96,435.2 μg的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

1.5.3 供試品溶液的制備 各精密稱取1.4.4中得到的三種不同洗脫部位冷凍干燥后的干粉適量,置10 ml容量瓶中,分別加入水,50%乙醇,95%乙醇至刻度,搖勻,即得。

1.6 培養(yǎng)基的制備

將濃度分別為10,85,70和18 g/L的瓊脂、玉米粉、蔗糖和酵母粉加蒸餾水煮沸,加入0.5%的丙酸配制成空白培養(yǎng)基。在空白培養(yǎng)基中分別添加濃度為0.15 mg/ml和3 mg/ml的水分離部位、50%乙醇分離部位和95%乙醇分離部位制備成含藥培養(yǎng)基。將空白和含藥培養(yǎng)基倒入相應(yīng)的果蠅培養(yǎng)管中,每管5 ml,用于實(shí)驗(yàn)。

1.7 黃芩不同分離部位對(duì)自然衰老果蠅壽命的影響

1.7.1 給藥劑量的設(shè)置 本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)0.04,0.2和1 mg/ml的黃芩素均能夠延長(zhǎng)雄性果蠅壽命,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)含量測(cè)定得到95%乙醇洗脫部位含有29.4%的黃芩素。通過(guò)換算,使95%乙醇洗脫部位低、高兩個(gè)劑量組分別含有約0.04和1 mg/ml的黃芩素,換算后的低、高給藥濃度約為0.15 mg/ml和3 mg/ml,為統(tǒng)一各部位的給藥劑量,故以黃芩素低、高兩個(gè)劑量為基準(zhǔn),使每個(gè)部位各設(shè)0.15 mg/ml和3 mg/ml兩個(gè)給藥濃度。

1.7.2 果蠅壽命實(shí)驗(yàn) 收集3 d內(nèi)羽化的雄性果蠅成蟲(chóng),隨機(jī)分為7組:空白對(duì)照組、水洗脫部位0.15 mg/ml組和3 mg/ml組(Water-0.15,Water-3)、50%乙醇洗脫部位0.15 mg/ml組和3 mg/ml組(50% Ethanol-0.15,50% Ethanol-3)、95%乙醇洗脫部位0.15 mg/ml組和3 mg/ml組(95% Ethanol-0.15,95% Ethanol-3),每組200只,于溫度25 ℃、濕度65%的恒溫恒濕自然光律交替的智能氣候箱中培養(yǎng),每3 d更換相應(yīng)的培養(yǎng)基。每日記錄果蠅的死亡數(shù)量,直至全部死亡,繪制生存曲線,計(jì)算平均、中位和最長(zhǎng)壽命。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 黃芩不同洗脫部位的出膏率

黃芩各洗脫部位出膏率計(jì)算方法如1.4.4所述,黃芩乙醇提取物的水洗脫部位出膏率為39.96%,50%乙醇洗脫部位出膏率為45.6%,95%乙醇洗脫部位的出膏率為4.42%。

2.2 黃芩不同洗脫部位主要化學(xué)成分定性分析結(jié)果

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖Figure 1 HPLC chromatogram of standard compounds

圖2 黃芩不同洗脫部位HPLC圖Figure 2 HPLC chromatogram of different eluting fractions of Scutellaria baicalensis Georgi

根據(jù)圖1中黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素的對(duì)照品HPLC色譜圖,對(duì)圖2中黃芩各洗脫部位HPLC色譜圖進(jìn)行指認(rèn),結(jié)果顯示,黃芩水洗脫部位的主要成分在紫外檢測(cè)器下基本無(wú)吸收,黃芩50%乙醇洗脫部位的主要成分為黃芩苷和漢黃芩苷,黃芩95%乙醇洗脫部位的主要成分為黃芩素和漢黃芩素。

2.3 黃芩不同洗脫部位對(duì)自然衰老果蠅壽命的影響

對(duì)空白對(duì)照組和黃芩不同分離部位給藥組的所有果蠅生存率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組相比,給予果蠅3 mg/ml水洗脫部位、0.15 mg/ml和3 mg/ml 50%乙醇洗脫部位均能顯著延長(zhǎng)果蠅的整體存活率。其中3 mg/ml水洗脫部位、0.15 mg/ml和3 mg/ml 50%乙醇洗脫部位分別能提高果蠅平均壽命8.4%,8.6%和8.4%(P<0.001,見(jiàn)圖3);0.15 mg/ml和3 mg/ml 50%乙醇洗脫部位分別能提高果蠅最高壽命3.4%(P<0.01)和2.8%(P<0.05,見(jiàn)表2)。

3 討論

目前中藥抗衰老有效成分的研究多集中于黃酮和多糖類成分。常小平等[9]對(duì)不同產(chǎn)地黃芩中黃酮類成分的含量進(jìn)行測(cè)定,發(fā)現(xiàn)各產(chǎn)地黃芩總黃酮含量均大于20.11%,黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素的含量分別大于10.98%,3.95%,1.05%,1.31%;石俊英等[10]對(duì)不同產(chǎn)地黃芩中多糖的含量進(jìn)行測(cè)定,發(fā)現(xiàn)各地黃芩粗多糖的含量均大于6.46%,總糖含量大于16.3%。本研究中HPLC色譜圖顯示,水分離部位中主要成分的紫外吸收較弱,應(yīng)主要為多糖類成分,50%乙醇部位中的主成分為黃芩苷和漢黃芩苷,95%乙醇部位中的主成分為黃芩素和漢黃芩素,這為考察這三個(gè)洗脫部位的抗衰老活性提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示黃芩水分離部位和50%乙醇洗脫部位能夠延長(zhǎng)果蠅壽命,證實(shí)了黃芩多糖和黃酮類化合物具有延緩衰老的作用。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)黃芩素具有抗衰老的活性[11],另外文獻(xiàn)報(bào)道漢黃芩素具有抗氧化、神經(jīng)保護(hù)和改善AD癥狀的作用[12-14]。而本研究結(jié)果顯示,黃芩95%乙醇分離部位未表現(xiàn)出延長(zhǎng)果蠅壽命的作用,且在3 mg/ml的濃度下還表現(xiàn)出縮短壽命的趨勢(shì),推測(cè)導(dǎo)致這種結(jié)果的原因如下:其一,黃芩95%乙醇洗脫部位不易溶于水,使配制的培養(yǎng)基中藥物分布不均勻,造成給藥不均勻。其二,黃芩黃酮類成分雖然藥理活性廣泛,但攝入量過(guò)高也會(huì)引起一定的毒副作用。Li等[15]通過(guò)細(xì)胞毒性試驗(yàn)證明了四種主要的黃酮類成分中黃芩苷的毒性最小,漢黃芩素的毒性最大。這是因?yàn)辄S芩苷和漢黃芩苷位點(diǎn)7上的D-吡喃葡糖苷糖醛酸對(duì)減小藥物毒性具有重要作用,而黃芩素和漢黃芩素的位點(diǎn)7上是羥基。因此當(dāng)黃芩素和漢黃芩素富集到一起給藥可能會(huì)加大毒性,并且給藥濃度過(guò)大使這種毒性表現(xiàn)出來(lái),引起果蠅生存率降低。其三,在設(shè)置給藥劑量時(shí),僅以黃芩素為基準(zhǔn)進(jìn)行換算,未考慮漢黃芩素,這使得給藥濃度的設(shè)置存在偏差。后期課題組將會(huì)改變黃芩95%乙醇分離部位的溶媒及給藥劑量重新考察其抗衰老作用。

圖3 黃芩不同洗脫部位對(duì)自然衰老果蠅模型壽命的影響Figure 3 Effect of different eluting fractions of Scutellaria baicalensis Georgi on life-span of natural aging Drosophila melanogaster

表2黃芩不同洗脫部位對(duì)自然衰老果蠅模型壽命的影響

Table2EffectsofdifferentelutingfractionsofScutellariabaicalensisGeorgionlifespanofnaturalagingDrosophilamelanogaster

分組平均壽命(d)中間壽命(d)P(時(shí)序檢驗(yàn))最大壽命(d)空白組50.0±0.952.0±0.8-67.6±0.6水-0.15 mg/ml51.6±0.854.0±1.10.19068.9±0.7水-3 mg/ml54.2±0.8???54.0±1.9<0.00168.7±0.350%乙醇-0.15 mg/ml54.3±0.8???56.0±1.2<0.00169.9±0.4??50%乙醇-3 mg/ml54.2±0.8???56.0±1.3<0.00169.5±0.5?95%乙醇-0.15 mg/ml51.6±0.951.0±1.00.33668.1±0.595%乙醇-3 mg/ml49.2±0.849.0±0.90.19267.4±0.6

與空白組相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001