楊 樺 韓肖燕 陳 田

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(recurrent spontaneous abortion，RSA)的病因十分復(fù)雜，主要包括遺傳因素、解剖因素、內(nèi)分泌因素、感染因素、免疫功能異常、血栓前狀態(tài)、卵巢衰老、孕婦的全身性疾病及環(huán)境因素等。RSA是嚴(yán)重危害女性健康及其生命全程包括老年期健康的常見病，病因?qū)W復(fù)雜，有50%的患者病因不明，因此一直是女性涉及生命全程的保健醫(yī)學(xué)的熱點(diǎn)和難點(diǎn)問題之一。妊娠不同時(shí)期的RSA，其病因有所不同，妊娠12周以前的早期流產(chǎn)多由遺傳因素、內(nèi)分泌異常、生殖免疫功能紊亂及血栓前狀態(tài)等所致；妊娠12周至28周之間的晚期流產(chǎn)且出現(xiàn)胚胎停止發(fā)育者，多見于血栓前狀態(tài)、感染、妊娠附屬物異常(包括羊水、胎盤異常等)、嚴(yán)重的先天性異常(如巴氏水腫胎、致死性畸形等)；且除此之外，臨床上還有近一半的RSA患者原因不明，稱為不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(Unexplained Recurrent Spontaneous Abortion，URSA)，是臨床上難治性疾病之一。該病對(duì)患者及其家屬的身心健康和生活質(zhì)量造成了嚴(yán)重?fù)p傷，因此，對(duì)RSA致病機(jī)理研究具有重要的治療指導(dǎo)意義。本研究進(jìn)行URSA與抗層粘連蛋白-1抗體的相關(guān)性研究，現(xiàn)將具體結(jié)果報(bào)道如下。

1.資料與方法

1.1 資料來源 URSA組選擇2015年1月至2016年12月在北京市友誼醫(yī)院婦產(chǎn)科復(fù)發(fā)性流產(chǎn)?？崎T診就診的URSA患者30例，平均年齡31.83歲(24～39歲)，所有患者就診前均連續(xù)自然流產(chǎn)2次以上，流產(chǎn)都發(fā)生于妊娠20周以前。URSA的診斷標(biāo)準(zhǔn)：①B超或子宮輸卵管碘油造影檢查排除子宮畸形或子宮頸機(jī)能不全；②子宮頸黏液支原體和衣原體培養(yǎng)排除感染因素；③患者夫妻雙方以及流產(chǎn)組織的染色體篩查排除染色體異常；④激素水平測(cè)定排除黃體功能不全、高催乳素血癥、高雄激素血癥以及代謝性疾病、甲狀腺功能異常等；⑤自身免疫性疾病相關(guān)抗體篩查，包括抗核抗體、抗心磷脂抗體、狼瘡抗凝物以及抗可提取核抗原(ENA)抗體均為陰性；⑥患者丈夫的精液檢測(cè)結(jié)果正常。對(duì)照組1選擇同期156例無不良妊娠史的健康婦女，平均年齡29歲(24～38歲)，對(duì)照組婦女均無肝、腎疾病，無自然流產(chǎn)史、早產(chǎn)史、血栓或出血史、妊娠期高血壓疾病史，并且至少有1次成功的妊娠分娩史。為保證遺傳背景的一致性，所有受試者(包括URSA組和對(duì)照組)均來自北京市西城區(qū)，簽署知情同意書后抽取血液標(biāo)本。對(duì)照組2按照年齡匹配因素，選擇同期50例無不良妊娠史的健康婦女作為對(duì)照，平均年齡30.90歲(28～35歲)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 應(yīng)用ELISE方法，層粘連蛋白-1抗體測(cè)定[1]：聚丙乙烯板(corning costa 9018)上包被10μg/ml的Laminin-1，體積為100μl/孔，封口，4度孵育過夜[2]。吸走棄去包被液。每孔加入250μlwash buffer，震蕩1min，清洗3次[3]。每孔加入200μl的10%的胎牛血清，室溫封閉1h[4]。wash buffer洗滌1次[6]。加入100μl梯度標(biāo)準(zhǔn)品或者1:400稀釋后的待測(cè)血清。并設(shè)置至少兩個(gè)孔的空白。封口，室溫孵育2h(或4度孵育過夜，提高靈敏度)[7]。wash buffer洗滌3～5次[8]。加入100μl 1:5000稀釋的HRP標(biāo)記的抗IgG抗體，室溫孵育1h[9]。洗滌，每次震蕩1～2min，wash buffer洗滌5～7次[10]。加入100μl/孔反應(yīng)底物TMB，室溫孵育15min[11]。每孔加入50μl終止液(stop solution)，在450nm波長(zhǎng)及570nm波長(zhǎng)檢測(cè)吸光度，結(jié)果用450nm吸光度值減去570nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度。

1.2.2 取受試者早晨空腹時(shí)肘靜脈血5ml，靜置1h后，2000r/min離心15min，取血清置于-70℃冰箱保存待測(cè)。按照試劑盒說明書應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法測(cè)定血清中的VEGF(Invitrogen)及s-Flt-1(Invitrogen)濃度。簡(jiǎn)要步驟為：①用Wash Buffer洗兩次Elisa孔；②在所有標(biāo)準(zhǔn)孔中倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品；③在指定樣品孔中加入50μl樣品；④向所有孔中加入50μl的Biotin-Conjugate；⑤在室溫下(18～25℃)，蓋上板子，孵化2h；⑥倒掉所有孔的溶液，Wash Buffer洗板子6次；⑦向所有孔中加入100μl稀釋的Streptavidin-HRP，室溫下孵育1h；⑧倒掉所有孔的溶液，用Wash Buffer洗板子6次；⑨向所有孔中加入100μl的TMB底物溶液，室溫下孵育30min；⑩向所有孔加入100μl Stop Solution；在450nm波長(zhǎng)及570nm波長(zhǎng)檢測(cè)吸光度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，差異性分析采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 一般臨床資料

2.1.1 由表1可見，兩組婦女的年齡沒有顯著差異(P=0.192)，具有可比性。對(duì)照組由于是孕中期的孕婦，因此體重指數(shù)明顯高于URSA組(P=0.001)。

表1 兩組一般臨床資料比較

2.1.2 血清中VEGF與sFlt-1的含量：URSA組血清VEGF濃度為67.14ng/ml，健康對(duì)照組VEGF濃度為75.27ng/ml，兩組沒有顯著性差異(P=0.435，見圖1)。URSA組血清Frees-Flt-1濃度為193.79pg/ml，健康對(duì)照組Free s-Flt-1濃度為336.76pg/ml，URSA組明顯低于對(duì)照組(P=0.00，見圖2)。

圖1 URSA組與健康對(duì)照組血清中VEGF的比較

圖2 URSA組與健康對(duì)照組血清中sFlt-1的比較

2.2 經(jīng)檢驗(yàn)，病例組與對(duì)照組血清中抗Laminin-1抗體沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.407)，見圖3。

圖3

3.討論

3.1 LN-1自身抗體與人類生殖障礙相關(guān)性 LN-1是由α1,β1,γ1鏈組成的異三聚體,最初是由RuperTimp等[1]于20世紀(jì)70年代從小鼠EHS肉瘤中分離出來的。其結(jié)構(gòu)為典型的三條短臂和一個(gè)長(zhǎng)臂組成的“十”字形,每條短臂上都有兩個(gè)小球形結(jié)構(gòu)，見圖4。LN-1屬于黏附分子整合素蛋白家族，為細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，是細(xì)胞黏附于基質(zhì)的重要介質(zhì)，與其受體結(jié)合后直接或間接控制細(xì)胞活動(dòng),如黏附或轉(zhuǎn)移、極化和分化、增殖或凋亡、基因表達(dá)及刺激癌細(xì)胞產(chǎn)生膠原酶等，并在滋養(yǎng)細(xì)胞的黏附、侵入過程中有重要作用。在胚胎種植之前,來自人類早期胚胎的LN-1增加了IV型膠原酶的表達(dá),促進(jìn)胚胎滋養(yǎng)層在母體著床。LN-1幾乎肯定是在發(fā)育的胚胎組織中最先表達(dá)的層粘連蛋白，因?yàn)樵谑蟀l(fā)育2～4細(xì)胞階段可以檢測(cè)到β1、γ1鏈的mRNA，在桑椹胚階段就可以檢測(cè)到α1鏈的分泌，它摻入到構(gòu)成滋養(yǎng)外胚層和絨毛膜基底膜中，也使自己和原始的內(nèi)胚層隔離開。在人類妊娠的前3個(gè)月胎盤的胚胎滋養(yǎng)層基底膜檢測(cè)到的LN-α1鏈,與基底膜和絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞直接接觸。妊娠3個(gè)月的胎盤，當(dāng)絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞形成錨定的胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞索時(shí)，能夠選擇性地在絨毛基底膜和增生擴(kuò)散的胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞島或索發(fā)現(xiàn)LN-1的存在。因此認(rèn)為，LN-1在胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞最初黏附并遷移入母體蛻膜過程中可能是必要的[1～3]。

抗LN-1自身抗體首先發(fā)現(xiàn)于有習(xí)慣性流產(chǎn)史的猴子血清中。該血清能引起培養(yǎng)的鼠胚胎發(fā)育異常，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，用鼠LN-1或其LN-1殘基免疫猴，猴血清會(huì)引起胚胎毒性，不孕或習(xí)慣性流產(chǎn)。用兔抗LN-1抗體被動(dòng)免疫妊娠鼠，能引起自發(fā)性流產(chǎn)。定位該抗體，發(fā)現(xiàn)其位于來自胚胎的Reicher’s膜和卵黃囊內(nèi)胚層細(xì)胞。臨床研究顯示，習(xí)慣性流產(chǎn)患者血清中的LN-1自身抗體IgG明顯升高。而且，其增高與其他IgG自身抗體如β2糖蛋白-1(β2GP1)依賴的抗心磷脂抗體(ACA)、狼瘡抗體(LA)、抗DNA抗體、抗核抗體等無關(guān)，研究表明，抗LN-1自身抗體與不孕及復(fù)發(fā)性流產(chǎn)明顯相關(guān)。結(jié)合LN-1在胚胎植入和胎盤形成中的作用，推測(cè)抗LN-1自身抗體可能在調(diào)節(jié)極早期的生殖過程中起作用，影響胚胎的早期發(fā)育及種植從而導(dǎo)致不孕[4～7]。

圖4 LN-1的模型示意圖(α1,β1,γ1鏈)

3.2 VEGF屬于血小板源性生長(zhǎng)因子家族，是一種作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的多功能因子，是最有力的促血管新生因子，主要作用是促進(jìn)血管連接再生，刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂和提高單層內(nèi)皮的通透性，維持血管內(nèi)皮細(xì)胞存活，并與胎盤因子形成異二聚體，促進(jìn)胎盤組織的有絲分裂。無論生理和病理環(huán)境下，均具有促血管生成的特性。在生理情況下的表達(dá)水平很低，而在人體代謝旺盛的組織如胚胎組織、胎盤、增生期子宮內(nèi)膜和黃體等常高水平表達(dá)，以滿足生長(zhǎng)發(fā)育的需要。VEGF受體的可溶性形式sflt-1具有強(qiáng)大的抗血管生成作用,不含酪氨酸激酶結(jié)合區(qū)域，不能傳達(dá)活化信號(hào)，同時(shí)抑制內(nèi)皮細(xì)胞的一氧化氮釋放合酶，降低其生物利用度，從而阻斷VEGF的生物學(xué)功能，成為體內(nèi)VEGF的天然拮抗劑，引起血管生成障礙并影響血管壁的完整性和通透性。文獻(xiàn)報(bào)道[8～11],抑制體內(nèi)sflt-1的生成可以提高妊娠成功率。這一研究首次證明了sflt-1會(huì)造成體內(nèi)VEGF的失衡,引起胎盤功能障礙,導(dǎo)致流產(chǎn)的發(fā)生。

3.3 本結(jié)果顯示：對(duì)照組及病例組的血清IL-1滴度無差異。VEGF及其受體的可溶性形式sflt-1，甚至得出相悖的結(jié)果，與既往研究結(jié)果不同，分析原因可能有以下幾點(diǎn)：①本課題組曾成功建立LN-I免疫的流產(chǎn)小鼠模型，證明在動(dòng)物中抗LN-1抗體確實(shí)與流產(chǎn)呈相關(guān)性，但在人類中并未得出類似的結(jié)論，考慮可能在人類中的年齡、肥胖、基因、環(huán)境等都有一定的影響[12～14]。②復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的原因復(fù)雜，不能用一種血清學(xué)標(biāo)記物完全解釋，尚需探索其他的原因，或者說本研究所涉及的血清學(xué)標(biāo)記物雖然可能解釋一部分原因，但是機(jī)體是一個(gè)復(fù)雜的多因素的個(gè)體，所以可以解釋在某一部分復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的人群中本研究的指標(biāo)并未成為復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的主要原因，也更加說明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的復(fù)雜性，目前所發(fā)現(xiàn)的每一個(gè)血清學(xué)指標(biāo)其實(shí)都無法完全用單一的原因去解釋和治療。③文獻(xiàn)多來自國(guó)外文獻(xiàn)，也可能存在種族差異、地域差異?？傊?，RSA是嚴(yán)重危害女性健康及其生命全程包括老年期健康的常見病，病因?qū)W復(fù)雜，因此闡明其病因一直是女性涉及生命全程的保健醫(yī)學(xué)的關(guān)鍵問題之一。