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(浙江省抗真菌藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江海正藥業(yè)股份有限公司，浙江 臺(tái)州 318000)

多黏菌素B(Polymyxin B，簡稱PMB)是一種由多黏類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)產(chǎn)生的氨基酸和脂肪組成的堿性多肽類抗生素。多黏菌素B為抗革蘭氏陰性菌的抗生素，對(duì)大多數(shù)革蘭氏陰性菌均有較強(qiáng)的抑制或殺菌作用，尤其是對(duì)綠膿桿菌效果極為顯著，對(duì)副大腸桿菌、肺炎克雷白桿菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、嗜酸桿菌、百日咳桿菌及痢疾桿菌等有較好的殺菌效果。多黏菌素自20世紀(jì)50年代用于臨床治療細(xì)菌感染，由于其存在一定的腎毒性和神經(jīng)毒性，20世紀(jì)70年代后臨床使用逐漸減少。在多黏菌素的不良反應(yīng)中，以腎毒性表現(xiàn)得比較突出。最近的研究中，多黏菌素誘導(dǎo)的臨床患者急性腎損傷發(fā)生率高達(dá)40%～60%，嚴(yán)重影響其在臨床中的使用[1]。近年來對(duì)多黏菌素潛在的肺細(xì)胞毒性的研究也是其臨床使用的參考依據(jù)[2]。作為治療多藥耐藥革蘭陰性菌引起嚴(yán)重感染的“最后一道防線”，多黏菌素重新引起了臨床的關(guān)注。

多黏菌素B由B1，B2，B3和B1-I四個(gè)主要組分組成[3]，臨床使用的多黏菌素主要組分的比例在不同品牌中存在差異，在同一品牌的不同批次中也存在差異，造成臨床療效的不穩(wěn)定[4-5]。研究表明：多黏菌素B不同組分及雜質(zhì)的存在會(huì)在一定程度上影響藥效，因此獲得單一組分的多黏菌素B1，更便于醫(yī)生在臨床上的監(jiān)測(cè)[6-7]。筆者考察了發(fā)酵培養(yǎng)基不同的氨基酸添加策略，期望可有效控制多黏菌素B的組分和雜質(zhì)的比例，在不影響發(fā)酵產(chǎn)量的前提下獲得發(fā)酵液中多黏菌素B1組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到80%以上的方法，并研究了補(bǔ)加發(fā)酵前體氨基酸對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的影響[8-10]。

1 材料與方法

1.1 菌 種

多黏類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)ATCC10401，購自美國菌種保藏中心。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 斜面培養(yǎng)基

葡萄糖5 g/L，蛋白胨8 g/L，氯化鈉5 g/L，牛肉膏5 g/L，瓊脂20 g/L，pH 6.8～7.0。

1.2.2 種子培養(yǎng)基

面粉50 g/L，葡萄糖15 g/L，酵母抽提物3 g/L，三水磷酸氫二鉀0.15 g/L，硫酸銨4.5 g/L，碳酸鈣3 g/L，消泡劑0.1 mL/L，pH 6.8～7.0。

1.2.3 發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基

面粉100 g/L，酵母抽提物1 g/L，三水磷酸氫二鉀0.2 g/L，硫酸銨5 g/L，碳酸鈣4 g/L，消泡劑0.1 mL/L，pH 6.8～7.0。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 發(fā)酵培養(yǎng)方法

將生長新鮮斜面接入種子培養(yǎng)基中，取20 mL種子液裝于250 mL三角搖瓶，搖床轉(zhuǎn)速250 r/min，28 ℃培養(yǎng)16～18 h，種子OD600為18～25。按2.5%的體積分?jǐn)?shù)接種量接入到發(fā)酵培養(yǎng)基，取20 mL發(fā)酵液裝于250 mL三角搖瓶。搖床轉(zhuǎn)速250 r/min,25 ℃培養(yǎng)72 h。

1.3.2 發(fā)酵罐培養(yǎng)方法

50 L發(fā)酵罐裝液量30 L，按體積分?jǐn)?shù)2.5%接種，培養(yǎng)溫度25 ℃，攪拌轉(zhuǎn)速150～300 r/min，溶氧20%～60%，培養(yǎng)周期72 h。

1.3.3 多黏菌素B檢測(cè)及計(jì)算方法

多黏菌素B組分高效液相檢測(cè)方法：色譜柱采用C18硅膠柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)； 4.46 g的無水硫酸鈉溶解到900 mL的水中，用稀磷酸調(diào)節(jié)pH至2.3，用水稀釋至1 000 mL，制成緩沖液；以V(乙腈)∶V(緩沖液)=20∶80為流動(dòng)相進(jìn)行分離，流速1.0 mL/min，紫外波長215 nm，進(jìn)樣量20 μL，柱溫30 ℃，多黏菌素B1峰的保留時(shí)間為40 min左右，運(yùn)行時(shí)間約為56 min(多黏菌素B1保留時(shí)間的1.4倍)。

發(fā)酵液HPLC檢測(cè)方法：發(fā)酵液用稀鹽酸或稀硫酸調(diào)節(jié)pH至4.0左右，取發(fā)酵液，用水稀釋5 倍，搖勻，超聲30 min，離心機(jī)4 000 r/min離心15 min，取上層水相，以0.22 μm水相針式濾膜過濾，過濾后液體通過高效液相色譜儀進(jìn)行組分檢測(cè)。

多黏菌素B標(biāo)準(zhǔn)品為USP REFERENCE STANDARD，標(biāo)準(zhǔn)品用配比為V(乙腈)∶V(水)=80∶20的溶液溶解稀釋，采用高效液相色譜檢測(cè)，圖譜如圖1所示。圖譜中的峰分別編號(hào)為1～22；B1組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)是指樣品20峰面積與1～22峰面積之和的比值，B2，B3，B1-I及所有雜質(zhì)計(jì)算方法相同；B1組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對(duì)值是指樣品與對(duì)照組20峰面積占比的比值，B2，B3，B1-I及所有雜質(zhì)計(jì)算方法相同；B1組分的效價(jià)=(樣品20峰面積÷標(biāo)準(zhǔn)20峰面積)×標(biāo)準(zhǔn)品B1質(zhì)量分?jǐn)?shù)×標(biāo)準(zhǔn)品B1配制濃度×稀釋倍數(shù)，B2，B3，B1-I及總效價(jià)計(jì)算方式相同。

圖1 多黏菌素B標(biāo)準(zhǔn)品圖譜Fig.1 HPLC chromatogram of Polymyxin B standard

2 結(jié)果與討論

2.1 不同前體氨基酸組合與多黏菌素B組分的關(guān)系

以1.2.3的發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)發(fā)酵配方，添加前體氨基酸L-亮氨酸(L-Leu)和L-異亮氨酸(L-Ile)分別進(jìn)行單因素和雙因素變量試驗(yàn),比較前體氨基酸對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物組分的影響，得到兩種前體氨基酸與組分之間存在的關(guān)系，結(jié)果如圖2～4所示。

1—0.50 g/L L-Leu+0.00 g/L L-Ile；2—0.50 g/L L-Leu+0.15 g/L L-Ile；3—0.50 g/L L-Leu+0.25 g/L L-Ile；4—0.50 g/L L-Leu+0.35 g/L L-Ile；5—0.50 g/L L-Leu+0.50 g/L L-Ile；6—0.50 g/L L-Leu+0.75 g/L L-Ile圖2 發(fā)酵中L-Leu質(zhì)量濃度與PMB組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的關(guān)系Fig.2 The relation of L-Leu mass concentration with PMB mass fraction in the fermentation

1—0.00 g/L L-Leu+ 0.50 g/L L-Ile；2—0.15 g/L L-Leu+0.50 g/L L-Ile；3—0.25 g/L L-Leu+0.50 g/L L-Ile；4—0.35 g/L L-Leu+0.50 g/L L-Ile；5—0.5 g/L L-Leu+0.50 g/L L-Ile；6—0.75 g/L L-Leu+0.50 g/L L-Ile圖3 發(fā)酵中L-Ile質(zhì)量濃度與PMB組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的關(guān)系 Fig.3 The relation of L-Ile mass concentration with PMB mass fraction in the fermentation

1—0.00 g/L L-Leu+0.00 g/L L-Ile；2—0.15 g/L L-Leu+0.15 g/L L-Ile；3—0.25 g/L L-Leu+0.25 g/L L-Ile；4—0.35 g/L L-Leu+0.35 g/L L-Ile；5—0.50 g/L L-Leu+0.50 g/L L-Ile；6—0.75 g/L L-Leu+0.75 g/L L-Ile圖4 發(fā)酵中L-Leu和L-Ile質(zhì)量濃度與PMB組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的關(guān)系Fig.4 The relation of L-Ile and L-Leu mass concentration with PMB mass fraction in the fermentation

由圖2～4可知：發(fā)酵罐中添加不同質(zhì)量濃度的L-leu和L-Ile時(shí)會(huì)影響多黏菌素組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，當(dāng)L-leu的添加量增加時(shí)，B1-I和B2組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低，B1組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加；當(dāng)L-Ile的質(zhì)量濃度增加時(shí)，B2組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低，B1和B1-I組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，其中B1-I與L-Ile的正相關(guān)性很大；當(dāng)L-Ile和L-leu的質(zhì)量濃度同時(shí)增加時(shí)，B2組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低，B1組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，因此，當(dāng)發(fā)酵中同時(shí)添加質(zhì)量濃度為0～0.75 g/L的前體氨基酸L-Ile和L-leu時(shí)，多黏菌素B1組分隨前體氨基酸濃度增加而增加，且兩種氨基酸加量相同時(shí)，多黏菌素B1組分增加幅度最高，B2組分隨前體氨基酸增加而減少，B1-I組分受L-Ile和L-leu的共同控制，B3組分受前體氨基酸的影響規(guī)律不明顯。

2.2 相同前體氨基酸(L-Leu和L-Ile)添加量與B1組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)、B1效價(jià)和PMB效價(jià)的關(guān)系

由圖4可知：在一定的范圍內(nèi)，當(dāng)發(fā)酵基礎(chǔ)配方中同時(shí)添加等量的L-Leu和L-Ile時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)物中多黏菌素B1組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，當(dāng)發(fā)酵基礎(chǔ)配方中添加等量的L-Ile和L-Leu時(shí)(分別為0～2.0 g/L)，多黏菌素B1組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)、多黏菌素B1效價(jià)、PMB效價(jià)與前體氨基酸加量的關(guān)系如圖5所示。

圖5 前體氨基酸添加量與B1組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)、B1效價(jià)、PMB效價(jià)的關(guān)系曲線Fig.5 The relation curve of addition of the same mass concentration precursor amino acid (L-Leu & L-Ile) with polymyxin B1 mass fraction and polymyxin B1 titer，PMB titer

由圖5可知：B1組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)先上升后趨于平穩(wěn)，添加前體氨基酸組合后B1組分較對(duì)照數(shù)據(jù)最高提升66.8%，B1效價(jià)先大幅度上升后趨于平穩(wěn)，添加前體氨基酸組合后B1效價(jià)最高提升105.8%，趨勢(shì)與B1組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)保持一致，添加前體氨基酸對(duì)發(fā)酵水平的影響較小。

2.3 不同氨基酸組合與多黏菌素B雜質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的關(guān)系

通過HPLC對(duì)發(fā)酵液中PMB雜質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果表明：雜質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)與前體氨基酸的添加量存在關(guān)聯(lián)，各雜質(zhì)的相對(duì)保留時(shí)間以B1為參考，通過對(duì)雜質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)與單一種前體氨基酸的添加量的比較，確定了前體氨基酸與雜質(zhì)之間的關(guān)系，結(jié)果如表1所示。

表1 前體氨基酸與雜質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)關(guān)系表1)Table 1 The relation of precursor amino acid on mass fraction of impurity

注：1) +越多表示雜質(zhì)與氨基酸的正相關(guān)性越大；-越多表示雜質(zhì)與氨基酸的負(fù)相關(guān)性越大。

單一氨基酸對(duì)雜質(zhì)的相關(guān)性很大，添加單一前體氨基酸不能提高多黏菌素B組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和B1效價(jià)，且使得雜質(zhì)超過限度，而添加氨基酸組合則很好地減弱了這種相關(guān)性，對(duì)于多黏菌素B的組分改變和B1效價(jià)提升更有利。

2.4 前體氨基酸組合獲得高含量多黏菌素B1

在基礎(chǔ)發(fā)酵配方中，添加等量的前體氨基酸(L-Leu和L-Ile)時(shí)，B1組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到最大。以發(fā)酵中添加1 g/L的前體氨基酸組合為例，當(dāng)添加L-Leu 0.5 g/L，L-Ile 0.5 g/L時(shí)，多黏菌素B1組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于其他組合，研究結(jié)果如圖6所示。

1—0.00 g/L L-Leu+1.00 g/L L-Ile；2—0.75 g/L L-Leu+0.25 g/L L-Ile；3—0.50 g/L L-Leu+0.50 g/L L-Ile；4—0.25 g/L L-Leu+0.75 g/L L-Ile；5—1.00 g/L L-Leu+0.00 g/L L-Ile圖6 相同前體氨基酸(L-Leu和L-Ile)加量不同組合方式對(duì)B1組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.6 The effect of precursor amino acid (L-Leu & L-Ile) different combination on mass fraction of polymyxin B1

由圖6可知：發(fā)酵中添加等量前體氨基酸(L-Leu & L-Ile)時(shí)，多黏菌素B1組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，因此，為了獲得高含量多黏菌素B1，選擇相同含量的氨基酸。

多黏菌素B的結(jié)構(gòu)里，除了上述試驗(yàn)的兩種前體氨基酸，L-Thr和D-Phe也作為前體氨基酸進(jìn)行添加。在添加了L-Leu 0.3 g/L和L-Ile 0.3 g/L的發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，分別添加0，0.25和0.50 g/L的L-Thr和D-Phe，結(jié)果見表2。

表2不同前體氨基酸組合與多黏菌素B1組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的關(guān)系

Table2TherelationofprecursoraminoacidcombinationwithmassfractionofPolymyxinB1

前體氨基酸質(zhì)量濃度/(g·L-1)L-LeuL-IleL-ThrD-PheB1組分平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%0.30.30066.080.30.30.25067.070.30.30.50066.300.30.300.2568.750.30.300.5070.81

由表2可知：發(fā)酵中添加適量的前體氨基酸D-Phe可增加發(fā)酵液中多黏菌素B1組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)。結(jié)合2.2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，通過驗(yàn)證，前體氨基酸組合為L-Ile 0.8 g/L，L-Leu 0.8 g/L和D-Phe 0.5 g/L時(shí)，多黏菌素B1的質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)到83.01%。

2.5 不同氨基酸組合在不同周期對(duì)多黏菌素B組分的影響

發(fā)酵過程中添加不同氨基酸組合，分別在24，48，72 h檢測(cè)多黏菌素B1和B2組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果如圖7，8所示。

1—0.00 g/L L-Leu+0.00 g/L L-Ile；2—0.30 g/L L-Leu+0.30 g/L L-Ile；3—0.50 g/L L-Leu+0.50 g/L L-Ile；4—0.80 g/L L-Leu+0.80 g/L L-Ile圖7 不同前體氨基酸(L-Leu和L-Ile)組合在不同發(fā)酵周期對(duì)多黏菌素B2組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.7 The effect of different precursor amino acid(L-Leu &L-Ile)combination on mass fraction of polymyxin B2 in the different fermentation period

1—0.00 g/L L-Leu+0.00 g/L L-Ile；2—0.30 g/L L-Leu+0.30 g/L L-Ile；3—0.50 g/L L-Leu+0.50 g/L L-Ile；4—0.80 g/L L-Leu+0.80 g/L L-Ile圖8 不同前體氨基酸(L-Leu和L-Ile)組合在不同發(fā)酵周期對(duì)多黏菌素B1組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.8 The effect of different precursor amino acid(L-Leu & L-Ile)combination on mass fraction of polymyxin B1 in the different fermentation period

由圖7，8可知：在不同的發(fā)酵周期添加不同質(zhì)量濃度的氨基酸組合時(shí)，多黏菌素B1組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨周期的變化幅度較小，不呈現(xiàn)規(guī)律性變化；B2組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨周期呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，但是不同前體氨基酸組合條件下，B2的增長幅度不一致。

2.6 不同周期添加前體氨基酸對(duì)多黏菌素B組分的影響

以發(fā)酵未添加前體氨基酸，與分別在0，24 h添加L-Leu 0.3 g/L+L-Ile 0.3 g/L的氨基酸組合方式，分別在24，48，72 h檢測(cè)B1和B2組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。以發(fā)酵周期72 h未添加前體氨基酸組為參照，所得B1和B2的質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對(duì)值與發(fā)酵周期的關(guān)系曲線如圖9，10所示。

圖9 發(fā)酵過程補(bǔ)加前體氨基酸組合與多黏菌素B1質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對(duì)值的關(guān)系曲線Fig.9 The relation curve of supplement precursor amino acid combination and relatively mass fraction of polymyxin B2

圖10 發(fā)酵過程補(bǔ)加前體氨基酸組合與多黏菌素B2質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對(duì)值的關(guān)系曲線Fig.10 The relation curve of supplement precursor amino acid combination and relatively mass fraction of polymyxin B2

由圖9，10可知：多黏菌素B1和B2兩個(gè)主要組分在生物合成過程中受前體氨基酸L-Leu和L-Ile的控制，發(fā)酵過程中補(bǔ)加前體氨基酸可重構(gòu)產(chǎn)物中多黏菌素B組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。生產(chǎn)中，發(fā)酵過程可通過調(diào)節(jié)添加氨基酸的量進(jìn)行控制，當(dāng)發(fā)酵液中部分雜質(zhì)和組分超標(biāo)時(shí)，通過補(bǔ)加氨基酸，調(diào)整發(fā)酵料液組分及雜質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，以達(dá)到質(zhì)量要求，也可通過連續(xù)補(bǔ)加氨基酸提高B1的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，從而提高發(fā)酵水平。

2.7 在發(fā)酵罐中添加前體氨基酸對(duì)多黏菌素B組分的影響

在50 L發(fā)酵罐中分別進(jìn)行未添加前體氨基酸與0 h添加L-Leu 0.5 g/L+L-Ile 0.5 g/L兩種方式的發(fā)酵，所得B1和B2組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化曲線如圖11，12所示。

圖11 50 L發(fā)酵罐中添加前體氨基酸組合時(shí)多黏菌素B1組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化曲線Fig.11 The change curve of mass fraction of polymyxin B2 and precursor amino acid combination in 50 L fermentator

圖12 50 L發(fā)酵罐中添加前體氨基酸組合時(shí)多黏菌素B2組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化曲線Fig.12 The change curve of mass fraction of Polymyxin B2 and precursor amino acid combination in 50 L fermentator

由圖11，12的結(jié)果可知：50 L發(fā)酵罐中添加前體氨基酸也會(huì)影響多黏菌素B組合組分變化，與2.5節(jié)搖瓶發(fā)酵結(jié)果一致。

3 結(jié) 論

多黏菌素B是一種包含4個(gè)組分的多組分物質(zhì)，臨床使用的不同品牌、不同批次的多黏菌素B的主要組分差異很大，造成了臨床療效的不穩(wěn)定[4-5]。多黏菌素B為脂肽類抗生素，L-Leu為B1組分的前體氨基酸，L-Ile與B1組分脂肪酸鏈有相同的尾部基團(tuán)，但L-Ile卻是B1-I的前體氨基酸，發(fā)酵過程中同時(shí)添加L-Ile和L-Leu時(shí)，兩者氨基酸的去向產(chǎn)生競(jìng)爭，L-Leu主要參與肽鏈的生物合成，L-Ile則主要參與脂肪酸鏈的生物合成，而且這種調(diào)控與氨基酸的含量有關(guān)。D-Phe則只參與肽鏈的生物合成，所以其對(duì)多黏菌素B組分的調(diào)節(jié)有局限性[11]。筆者在發(fā)酵中通過添加氨基酸控制組分含量，不同的氨基酸組合、培養(yǎng)周期和氨基酸的補(bǔ)加時(shí)間都是影響組分差異的因素，通過控制相關(guān)參數(shù)獲得達(dá)到質(zhì)量要求的產(chǎn)物。氨基酸也會(huì)影響雜質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，研究獲得了不同氨基酸與雜質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的關(guān)系。當(dāng)發(fā)酵中同時(shí)添加前體氨基酸L-Ile和L-leu時(shí)，多黏菌素B1組分隨前體氨基酸量增加而增加，且兩種氨基酸加量相同時(shí)，增加幅度最高，B2組分隨前體氨基酸增加而減少，B1-I組分受L-Ile和L-leu的共同控制，L-Ile促進(jìn)B1-I的生成，L-Leu抑制B1-I的產(chǎn)生，B3組分受前體氨基酸的影響規(guī)律不明顯，并且前體氨基酸L-Ile和L-Leu會(huì)影響雜質(zhì)的組成和總雜質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化。其他前體氨基酸如D-Phe對(duì)多黏菌素B的生成亦有促進(jìn)作用，當(dāng)實(shí)驗(yàn)中前體氨基酸組合為L-Ile 0.8 g/L+L-Leu 0.8 g/L+D-Phe 0.5 g/L時(shí)，多黏菌素B1質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)到83.01%。利用氨基酸與發(fā)酵組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的關(guān)系，得出了獲得高質(zhì)量分?jǐn)?shù)多黏菌素B1的方法，對(duì)于生產(chǎn)單組分多黏菌素B具有重要價(jià)值，氨基酸對(duì)于多黏菌素B組分調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究。