劉菲 張云濤 馬向瑞 張雅杰 王云浩 .濱州醫(yī)學院口腔醫(yī)學院 濱州 56600；

2.濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院口腔修復科 濱州 256600；

3.濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院口腔頜面外科 濱州 256600

鈦及鈦合金被廣泛應用于口腔種植治療中，通過表面改性提高鈦及鈦合金種植體與骨的結合，是目前研究的熱點。生物化修飾種植體可使種植體表面具有生物活性，使之形成與天然骨相似的結構與組成，從而調控細胞行為，可促進種植體與骨結合，增強骨結合強度，從而縮短種植體早期負載的時間。

精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸（arginyl-glycylaspartate，RGD）多肽是細胞膜整合素的特異性配體，與相應細胞膜上的整合素亞基識別并與之結合，從而形成特異性的黏附，同時可激活相關基因，促進細胞黏附、增殖、分化及相關基因的表達[1]。

本實驗采用層層自組裝技術，用RGD多肽修飾純鈦表面，可使帶有相反電荷的不同電解質在材料表面相互交替吸附、沉積，從而在鈦片表面形成具有特定厚度的多層自組裝多肽復合薄膜[2]，在復合薄膜表面進行成骨細胞培養(yǎng)，檢測細胞的黏附、增殖以及骨鈣素和骨保護素的表達。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗鈦片 1）TA4鈦片（成都海利華生物科技有限公司），直徑15 mm，厚1 mm，粗糙度為（0.20±0.02）μm。丙酮、75%乙醇、純水中超聲清洗各15 min，60 ℃干燥。2）NaOH處理鈦片，將清潔后干燥試件浸沒在5 mol·L-1NaOH溶液中60℃水浴24h，在80℃去離子水中保溫24h，60 ℃干燥備用。

1.1.2 RGD多肽涂層的制備 將NaOH處理后的鈦片浸入2.5 mg·mL-1聚乙烯亞胺（polyethyleneimine，PEI；Sigma公司，美國）水溶液中30 min，去離子水沖洗20 min；干燥后浸入含0.2 mg·mL-1RGD多肽的0.4 mg·mL-1NaHCO3溶液8h，去離子水沖洗20 min，60 ℃干燥；再將樣本浸入2.5%戊二醛30 min，去離子水沖洗30 min，60 ℃干燥。重復上述過程10個循環(huán)，形成多層RGD多肽覆蓋層[3]。

1.1.3 主要材料 小鼠成骨樣細胞MC3T3-E1（中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫），α-Eagle基礎培養(yǎng)基（α-minium Eagle's medium，α-MEM；Hyclone公司，美國），胎牛血清（浙江天杭生物科技公司），青霉素/鏈霉素溶液（Hyclone公司，美國），2.5 g·L-1胰蛋白酶（Hyclone公司，美國）， 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT；Sigma公司，美國]，二甲基亞砜（dimethyl sulphoxide，DMSO；Amresco公司，美國），Trizol試劑（北京Takara公司），反轉錄試劑盒（PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser；TaKaRa公司，日本）、SYBR GreenMasterMix（TaKaRa公司，日本）。

1.1.4 主要儀器 CO2細胞培養(yǎng)箱（Thermo Fisher Scientific公司，美國），超凈工作臺，掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM；EVO LS15；Zeiss公司，德國），全自動多功能酶標儀（Thermo lab systems multiskan mk3，美國），熒光實時定量多聚酶鏈式反應儀（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR；Rotor-Gene3000；Corbett公司，澳大利亞）。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 以無鈦片為對照組，分別以未做表面處理的純鈦（pure titanium，PT）、NaOH處理后鈦片（NaOH-treated titanium，NT）和RGD多肽涂層鈦片（RGD-modified titanium，RT）為實驗組，共分4組。

1.2.2 材料表面微觀形貌觀察 用SEM在20 kV、放大5 000倍條件下觀察各組鈦片表面微觀形貌。

1.2.3 細胞體外培養(yǎng) 小鼠成骨樣細胞MC3T3-E1在5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，每2 d換液1次，培養(yǎng)液為α-MEM（含10%胎牛血清，1%青霉素/鏈霉素）。待細胞長滿培養(yǎng)瓶底后，按1：3傳代，傳代3次后用于實驗。

1.2.4 細胞黏附檢測 將3組鈦片置于24孔細胞培養(yǎng)板孔內，無鈦片放置的孔為對照組，每組8個樣本。每孔用1 mL的75%乙醇浸泡30 min，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）沖洗3遍，吸出液體。將細胞以2×104mL-1接種于各組孔內（每孔1 mL），分別在1、4、12、24 h時間點，采用MTT法在490 nm波長處測定各孔吸光度值。

1.2.5 SEM觀察細胞的黏附形態(tài) 將小鼠成骨樣細胞MC3T3-E1以2×104mL-1接種于各組孔內（每孔1 mL），培養(yǎng)12 h，使用SEM在10 kV、放大1 000倍條件下觀察細胞的黏附形態(tài)。

1.2.6 細胞增殖檢測 將小鼠成骨樣細胞MC3T3-E1以2×104mL-1接種于各組孔內（每孔1 mL），每組8個樣本。培養(yǎng)1、3、5、7 d后，采用MTT法在490 nm波長處測定各孔吸光度值。

1.2.7 RT-qPCR檢測骨鈣素、骨保護素mRNA表達水平 將小鼠成骨樣細胞MC3T3-E1以5×104mL-1接種于各組孔內（每孔1 mL），每組6個樣本。待細胞生長覆蓋80%表面積，將培養(yǎng)液更換為成骨誘導液，分別在成骨誘導的7、14 d，用Trizol提取總RNA，反轉錄合成互補DNA（complementary DNA，cDNA）。編碼作為內參物的磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH）與目標物骨鈣素、骨保護素的基因的引物由上海生工生物工程公司合成。GAPDH上游：5'-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3'，下游：5'-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3'；骨鈣素基因上游：5'-GGTAGTGAACAGACTCCGGC-3'，下游：5'-GGCGGTCTTCAAGCCATACT-3'；骨保護素基因上游：5'-CCACTCGAACCTCACCACAG-3'，下游：5'-TCGCTCGATTTGCAGGTCTT-3'。反應程序為95 ℃預變性30 s，1 次循環(huán)；PCR擴增， 95 ℃ 5 s，60 ℃ 30s，45次循環(huán)。將對照組基因表達量定義為1，計算每組的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據(jù)均以平均值±標準差的形式表示，采用SPSS 17.0對各組數(shù)據(jù)行單因素方差分析，組內兩兩比較用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 SEM觀察

使用SEM觀察各組鈦片的表面情況（圖1）。打磨后的PT組鈦片，表面光滑，有均勻一致較清晰的劃痕結構；NT組鈦片表面的劃痕結構變得不明顯，出現(xiàn)更為細小的結構，類似小微孔結構；RT組鈦片表面結構無明顯打磨后的痕跡，細小結構更明顯，類似小凸起，似網狀鋪在表面。

圖1 鈦片的表面形態(tài) SEM × 5 000Fig 1 Surface topography of the titanium plates SEM × 5 000

2.2 細胞在不同鈦片表面的黏附情況

統(tǒng)計結果（表1）顯示，RT組鈦片小鼠成骨樣細胞MC3T3-E1的黏附情況明顯好于其余3組。NT組細胞的黏附率情況則較差。

2.3 SEM觀察細胞在不同鈦片表面的黏附形態(tài)

使用SEM觀察小鼠成骨樣細胞MC3T3-E1的黏附情況（圖2），可見細胞貼壁生長。

PT組鈦片表面細胞呈扁平狀，多為多邊形，有少量偽足；NT組鈦片表面細胞伸展良好，呈扁平狀，形態(tài)各不相同，偽足較多；RT組鈦片表面細胞呈不規(guī)則多邊形，伸展良好，大量絲狀偽足牢固附著或深入在材料表面。

表1 不同鈦片表面對小鼠成骨樣細胞MC3T3-E1在不同時間點黏附的影響Tab 1 The effect of different titanium plates on the adhesion of MC3T3-E1

圖2 鈦片表面小鼠成骨樣細胞MC3T3的黏附形態(tài) SEM × 1 000Fig 2 Adhesion morphology of MC3T3 on surface of titanium plates SEM × 1 000

2.4 細胞在不同鈦片表面的增殖情況

小鼠成骨樣細胞MC3T3-E1培養(yǎng)1和3 d，RT組細胞增殖率最高。在5和7 d時，RT組細胞的增殖情況與對照組、PT組無明顯差異；NT組細胞的增殖情況則最差，差異有統(tǒng)計學意義。

2.5 不同鈦片表面對小鼠成骨樣細胞MC3T3-E1骨鈣素、骨保護素mRNA表達的影響

采用RT-qPCR檢測培養(yǎng)7 d時的小鼠成骨樣細胞MC3T3-E1，RT組細胞骨鈣素mRNA的表達水平與PT組和NT組細胞的表達水平之間的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；培養(yǎng)14 d時，與PT組相比，RT組和NT組細胞骨鈣素mRNA的水平明顯升高（P＜0.05）。骨保護素mRNA在培養(yǎng)7和14 d時的表達有相同的趨勢，RT組和NT組均明顯高于PT組（P＜0.05），其中RT組骨保護素mRNA的表達量也較NT組明顯上調（P＜0.05）。

表2 不同鈦片表面對小鼠成骨樣細胞MC3T3-E1增殖的影響Tab 2 The effect of different titanium plates on the proliferation of MC3T3-E1

圖3 不同鈦片表面對小鼠成骨樣細胞MC3T3-E1骨鈣素、骨保護素mRNA表達的影響Fig 3 mRNA expression of osteocalcin and osteoprotegerin in MC3T3-E1 on different titanium plates at different times

3 討論

RGD多肽是存在于細胞黏附蛋白中的短肽序列，細胞膜上的整合素亞基是介導細胞黏附的重要跨膜受體[3]。RGD多肽作為細胞黏附蛋白與相應細胞的結合位點，與被黏附細胞的細胞膜整合素亞基識別并結合，增強其與細胞間的黏附與增殖[4]。Hoyos-Nogués等[5]利用RGD多肽修飾材料，使材料表面具有生物活性及骨誘導作用，促進細胞在材料表面的附著和鋪展，從而促進細胞的黏附、增殖。在本研究中，RGD多肽修飾鈦片的表面與經NaOH處理后的鈦表面相比，表面潤濕性提高，表面能降低，利于細胞的識別[6]。SEM觀察顯示，在RGD多肽涂層鈦片表面，培養(yǎng)12 h的小鼠成骨樣細胞MC3T3-E1有大量絲狀偽足，鋪展充分，緊密附著在材料表面，這可能是因鈦片表面RGD多肽與細胞膜整合素亞基識別并與之結合，促進細胞在鈦片表面更好鋪展。RGD多肽能促進小鼠成骨樣細胞MC3T3-E1的早期增殖，細胞在培養(yǎng)1和3 d時，增殖情況明顯高于其他3組。Chen等[7]將RGD多肽化學固定于鈦片表面，培養(yǎng)小鼠成骨樣細胞MC3T3-E1，發(fā)現(xiàn)3和5 d時細胞的增殖率均較未涂層鈦有所增加，其結果與本實驗結果一致。NT組鈦片表面的細胞增殖情況明顯低于對照組及PT組，這與之前的研究[8-9]不同，可能是由于鈦片處理的方式不同導致表面的粗糙度不同。

骨鈣素是成骨細胞分化后期的最具特征性的標志物，是判斷其分化成骨能力的重要指標[10]。后期骨鈣素mRNA水平上調，說明RGD多肽促進了小鼠成骨樣細胞MC3T3-E1的分化成骨。骨保護素又被稱為骨保護蛋白，可以與核因子κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor κB ligand，RANKL）結合，從而競爭性地阻斷了破骨細胞與RANKL結合，抑制了破骨細胞的分化，降低了破骨細胞的活性，誘導破骨細胞的凋亡，對于防止骨質吸收起到了調節(jié)作用[11]。骨保護素在成骨細胞中高表達，說明對骨吸收有抑制作用。在本實驗中，RT組鈦片可以使細胞分化后期的骨鈣素mRNA水平上調，促進了細胞的成骨分化，同時還能通過上調骨保護素，從而抑制破骨細胞分化，減少骨的吸收。Chua等[12]通過自組裝技術在鈦表面添加RGD多肽并進行細胞實驗，結果證明促進了成骨細胞黏附性、增殖及細胞堿性磷酸酶活性。Raphel等[13]的研究也證實，鈦表面用RGD多肽修飾后有利于成骨細胞后期的分化。

種植體周圍骨質形成的速度、骨結合強度和骨結合時間是種植體成功的關鍵。鈦在空氣中易形成氧化物薄膜，表面無法提供足夠的功能基團來固定生物分子，需對其進行處理。目前對種植體表面進行多肽修飾的方法有物理吸附、化學固定及層層自組裝技術等。物理吸附通過非共價鍵吸附于材料表面，操作簡便，但其形成的RGD多肽覆蓋層厚薄不一，且與種植體表面結合穩(wěn)定性較差。化學固定用酸或過氧化氫溶液作修飾試劑，獲得修飾材料的功能基團，可其破壞種植體表面的原有形貌，影響種植體骨結合。層層自組裝技術中鈦片經過NaOH處理會活化其表面，使之獲得大量帶有負電荷的羥基，有利于自組裝，可保證RGD多肽的數(shù)量和結合強度[14]。采用SEM觀測材料表面形貌，經過NaOH處理的鈦片的表面劃痕結構消失，出現(xiàn)微孔結構，而層層自組裝RGD多肽修飾的鈦片的表面出現(xiàn)了微小凸起結構，這種結構可能與正負電荷交替吸附形成的RGD多肽涂層有關。

與物理吸附和化學固定方式相比，采用層層自組裝方式用RGD多肽修飾鈦片有其獨特的優(yōu)勢，可以不破壞材料表面的形態(tài)，可有效控制多肽厚度，且操作簡單。多肽層層自組裝的原理被認為是多肽分子間非共價鍵的作用力，對自組裝原理的研究對于準確預測和控制自組裝聚集體的結構有著極為重要的作用。RGD多肽修飾鈦片能促進小鼠成骨樣細胞MC3T3-E1的黏附和增殖，并且能夠上調骨鈣素和骨保護素mRNA的表達，從而能增強細胞的成骨能力，加快種植體骨結合，有利于早期種植體的穩(wěn)定性，提高種植體植入的成功率，其臨床應用價值巨大。然而，多肽分子自組裝的設計不同，其形成的化學結構也不盡相同。在本實驗中，多肽涂層的結構并不完全明確，哪種結構更加有利于細胞的黏附、生長及促進成骨，以及在動物實驗中是否能達到早期愈合的效果，仍需進一步研究，也是筆者后續(xù)研究的主要目標。