楊佳幸，欒英橋，沈晗，邵紅偉，張文峰

(廣東藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院/廣東省生物技術(shù)候選藥物研究重點實驗室，廣東 廣州 510006)

CAR-T細(xì)胞免疫療法(chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy)即嵌合抗原受體T細(xì)胞免疫療法。2017年8月31日，美國FDA正式批準(zhǔn)諾華的CAR-T療法上市(CTL019)；2017年10月19日，F(xiàn)DA 宣布批準(zhǔn)了吉利德旗下凱特公司的另一款CAR-T療法(KTE-C19)上市。2種CAR-T療法的相繼上市標(biāo)志著CAR-T細(xì)胞治療的療效和整個商業(yè)化流程都獲得了FDA的正式認(rèn)可，也會對其他細(xì)胞治療產(chǎn)生積極的影響，加速更多細(xì)胞治療產(chǎn)品的上市。

CAR-T療法的基本原理是通過基因工程技術(shù)將識別腫瘤抗原分子的抗體可變區(qū)基因序列，與淋巴細(xì)胞免疫受體的胞內(nèi)區(qū)序列融合成嵌合分子，然后利用病毒載體介導(dǎo)嵌合分子轉(zhuǎn)導(dǎo)到T淋巴細(xì)胞內(nèi)，于細(xì)胞表面表達(dá)融合蛋白，將此T細(xì)胞回輸?shù)襟w內(nèi)，其能通過非MHC限制性方式識別特定抗原，發(fā)揮其識別和殺傷腫瘤的能力，從而達(dá)到特異性靶向殺傷腫瘤細(xì)胞的效果。然而，CAR-T療法在腫瘤臨床治療中存在脫靶效應(yīng)、細(xì)胞因子釋放綜合征等毒副作用，本文針對這些毒副作用的優(yōu)化方案進(jìn)行總結(jié)。

1 針對脫靶效應(yīng)的優(yōu)化方案

1.1 構(gòu)建雙特異性CAR-T

CAR對1種腫瘤相關(guān)抗原(tumor-associated antigen，TAA)的識別可能增加其靶向非腫瘤細(xì)胞的風(fēng)險。1篇關(guān)于靶向原癌基因人類表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor-2，HER2)的CAR-T細(xì)胞治療的病例報告顯示，患者由于肺上皮細(xì)胞HER2水平低而產(chǎn)生了嚴(yán)重的毒性副作用并死亡[1]，另外有研究表明CD19-CAR T細(xì)胞也會靶向正常B細(xì)胞，導(dǎo)致B細(xì)胞發(fā)育不全[2-5]。當(dāng)2種靶標(biāo)都存在時，CAR對每個靶標(biāo)的較低親和力僅針對表達(dá)單靶標(biāo)的非腫瘤細(xì)胞，并且可能引起強(qiáng)烈的CAR T細(xì)胞活化。 研究人員就將能識別2種不同特異性抗原的抗體放在1個CAR-T系統(tǒng)上，增強(qiáng)其特異性，限制了T細(xì)胞的活化，從而降低脫靶率。目前使用的嵌合受體包括ICAR(inhibitory chimeric antigen receptor)，CCR(CC chemokine receptor)和synNotch受體(synthetic Notch)等。

ICAR是來源于PD-1或CTLA-4受體的合成抑制性受體，能夠競爭性抑制CAR的活性，ICAR能夠識別存在于正常細(xì)胞而腫瘤細(xì)胞中不存在的抗原，從而保護(hù)正常細(xì)胞免受CAR-T細(xì)胞的靶向破壞[6]。減少了對正常組織的損傷細(xì)胞毒素作用，避免或減少脫靶效應(yīng)。這樣，在CAR T細(xì)胞保持其抗腫瘤活性的同時能夠預(yù)防腫瘤毒性。Fedorov等[6]通過構(gòu)建胞內(nèi)域抑制性分子 PD-1 或 CTLA4 受體的 iCAR，驗證了此方法可控制 CAR-T 活化及應(yīng)答。

趨化因子是一類小分子堿性蛋白,是能夠趨化細(xì)胞定向移動的小分子細(xì)胞因子，趨化因子與細(xì)胞表面的特異性受體的相互作用在腫瘤形成和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。另一種雙特異性CAR-T的構(gòu)建利用了2種受體之間的互補(bǔ)信號：用于T細(xì)胞活化的識別第一抗原的CAR和用于共刺激識別第二抗原的趨化因子受體[7]。只有目標(biāo)細(xì)胞同時表達(dá)這2種抗原才會持續(xù)激活CAR-T細(xì)胞，增加了CAR-T細(xì)胞殺傷作用的特異性。有研究者設(shè)計出靶向前列腺腫瘤2種抗原PSMA和PSCA的T細(xì)胞。結(jié)果顯示此CAR-T細(xì)胞能夠殺傷表達(dá)2種抗原的腫瘤細(xì)胞但不影響單獨表達(dá)任一抗原的腫瘤[8]。

1.2 靶向腫瘤特異性糖基化靶點

CAR-T療法所針對的靶點如果僅僅滿足相對于正常細(xì)胞的高表達(dá)，并不足以滿足臨床實驗所需要的安全性，而特異性的糖基化靶點就成為一個突破口。

2016年，美國賓夕法尼亞大學(xué)Carl June團(tuán)隊通過實驗證實靶向異常糖基化MUC1分子的CAR-T療法是打破實體瘤免疫耐受的突破口[9]。在腫瘤細(xì)胞表面，最常見的異常糖基化形式是Tn(GalNAca1-O-Ser/Thr)和唾液酸-Tn(Sialy-Tn，STn-NeuAca2-6-GalNAca1-O-Ser/Thr)。Tn和STn異常糖基化形式在腫瘤細(xì)胞表面的MUC1蛋白上非常常見，但在正常細(xì)胞上不會有Tn抗原的表達(dá)。利用新開發(fā)抗體5E5的單鏈抗體區(qū)域靶向癌細(xì)胞表面Tn-MUC1抗原骨架內(nèi)的Tn和STn抗原表位，結(jié)果顯示5E5 CAR-T細(xì)胞由體外MUC19-Tn刺激產(chǎn)生的大量細(xì)胞因子(IL-2和IFN-γ)，證明了5E5-CAR-T細(xì)胞對MUC1-9Tn的高結(jié)合親和力和靶向性。

2 針對細(xì)胞因子釋放綜合征的優(yōu)化策略

2.1 誘導(dǎo)CAR-T細(xì)胞凋亡的自殺基因

CAR-T細(xì)胞療法經(jīng)常導(dǎo)致脫靶效應(yīng)，引起細(xì)胞因子釋放綜合征(cytokine release syndrome,CRS)[10]，臨床中需要用類固醇和/或抗IL6受體抗體tocilizumab治療。研究人員發(fā)現(xiàn)可以通過誘導(dǎo)自殺基因的表達(dá)來選擇性消除CAR-T細(xì)胞。自殺基因是指在CAR-T細(xì)胞中導(dǎo)入1個共表達(dá)的病毒或者細(xì)菌基因，當(dāng)不良反應(yīng)發(fā)生時，在無毒性前體藥物刺激下，激活CAR-T細(xì)胞中這些病毒或者細(xì)菌基因的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo) CAR-T細(xì)胞凋亡，從而減少毒性。

編碼單純皰疹病毒胸苷激酶的基因可以使鳥嘌呤核苷類似物更昔洛韋磷酸化，其三磷酸產(chǎn)物作用于 DNA 聚合酶，引起鏈終止反應(yīng)使細(xì)胞凋亡[11]，從而防止CAR-T細(xì)胞過度活化，防止分泌過多細(xì)胞因子而產(chǎn)生CRS。另一個常用的自殺基因為可誘導(dǎo)的Caspase9基因(inducible caspase9)，使CAR-T細(xì)胞表達(dá)CAR的同時共表達(dá)iCasp9，可以通過外界化學(xué)藥物誘導(dǎo)icasp9的二聚化啟動細(xì)胞的線粒體凋亡通路使CAR-T細(xì)胞凋亡，提高CAR-T細(xì)胞治療的臨床安全性[12]。

2.2 控制CAR-T細(xì)胞輸注劑量

由于CRS是CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)被激活產(chǎn)生細(xì)胞因子而引起，且CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)擴(kuò)增可達(dá)到1 000倍以上，高劑量的CAR-T細(xì)胞輸注可能會導(dǎo)致CRS出現(xiàn)得更早。因此，應(yīng)限制首次輸注的細(xì)胞數(shù)量。1名臨床患者1次性接受1010個CAR-T細(xì)胞的靜脈輸注，在細(xì)胞輸注15 min后即出現(xiàn)肺水腫，盡管及時給予機(jī)械通氣及地塞米松治療，仍于5 d后死亡[1]。一些研究已經(jīng)設(shè)計出在腫瘤特異性T細(xì)胞表達(dá)IL-12，誘導(dǎo)腫瘤局部化的IL-12分泌。在B16鼠黑素瘤模型中，當(dāng)施用超過5×105個細(xì)胞時，分泌IL-12的腫瘤反應(yīng)性pmel-1 CD8+T細(xì)胞仍然導(dǎo)致小鼠體質(zhì)量減輕以及存活率降低[13]。在施用沒有副作用的較低細(xì)胞數(shù)目時，B16黑素瘤中的積聚和抗腫瘤活性增加。由于各臨床試驗中嵌合抗原受體的結(jié)構(gòu)、T細(xì)胞培養(yǎng)方法及患者納入標(biāo)準(zhǔn)不同，無法對劑量遞增方案作出統(tǒng)一規(guī)定，臨床醫(yī)師應(yīng)該根據(jù)臨床前實驗結(jié)果，結(jié)合患者個體腫瘤類型、腫瘤負(fù)荷作出具體調(diào)整。

2.3 CAR-T細(xì)胞施用途徑

改變CAR-T細(xì)胞施用途徑能夠減少CRS產(chǎn)生的毒性反應(yīng)。瘤內(nèi)注射CAR-T細(xì)胞可限制CAR-T療法的脫靶效應(yīng)，注射部位包括顱內(nèi)、胰腺等。在小鼠膠質(zhì)母細(xì)胞瘤模型中，將Tan CAR-T細(xì)胞在惡性膠質(zhì)瘤原位移植小鼠模型上進(jìn)行瘤內(nèi)注射，結(jié)果Tan CAR-T細(xì)胞抑制了抗原逃逸，具有更強(qiáng)的抗腫瘤效力，并且改善了動物存活率[14]。有研究人員進(jìn)行了一項Ⅰ期臨床試驗，將CD4(+)T細(xì)胞施用于局部晚期/復(fù)發(fā)頭頸部鱗狀細(xì)胞癌患者。臨床試驗采用藥物劑量緩慢遞增的瘤內(nèi)給藥方案，取得了較好的治療效果且未出現(xiàn)CRS毒性反應(yīng)[1,15]

2.4 治療性血漿置換術(shù)(therapeutic plasma exchange,TPE)

在大多數(shù)患者中，通過藥物治療和支持治療可以很好地控制CRS。然而，盡管接受常規(guī)治療，少數(shù)患者死于腦水腫或由CRS引起的多器官功能衰竭[16]。

Xia Xiao等[17-18]根據(jù)使用TPE治療甲狀腺風(fēng)暴(thyroid storm)和胰腺炎的臨床案例，對患有復(fù)發(fā)難治性急性淋巴細(xì)胞白血病患者進(jìn)行了TPE聯(lián)合糖皮質(zhì)激素治療。該患者在輸注抗CD19 CAR-T細(xì)胞后出現(xiàn)危及生命的CRS。該病例表明，TPE可以清除血漿中的細(xì)胞因子，對一些嚴(yán)重CRS患者進(jìn)行血漿置換術(shù)是可行的。這種類型的TPE必須由經(jīng)驗豐富的醫(yī)務(wù)人員執(zhí)行，因為它可能伴有并發(fā)癥。一旦CRS用常規(guī)治療無法緩解，TPE可以是CAR-T細(xì)胞輸注后的替代治療方式。

3 針對傳輸載體的優(yōu)化策略

目前在CAR-T細(xì)胞療法中主要采用病毒載體介導(dǎo)嵌合受體感染T細(xì)胞并在其細(xì)胞膜表達(dá)，目前使用最廣泛為慢病毒載體。考慮到慢病毒整合宿主染色體的特性，已有使用慢病毒載體導(dǎo)致產(chǎn)生T淋巴瘤的報道[19]，因此不適合在臨床治療中使用。

2018年發(fā)表的關(guān)于CAR-T的2個臨床報道更是增加了臨床使用慢病毒載體的憂慮。2018年5月，來自賓夕法尼亞大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Carl H June團(tuán)隊在《自然》雜志上發(fā)表1篇論文，報道他們在給1名患者制作CAR-T時，有1個CAR序列被隨機(jī)整合到了TET2基因中，導(dǎo)致了該基因功能障礙[20]。正是這個隨機(jī)地整合，賦予了這個CAR-T細(xì)胞更強(qiáng)增殖能力和抗腫瘤能力。半年后Carl H June團(tuán)隊再次在《自然醫(yī)學(xué)》上發(fā)表了一個令人震驚的CAR-T細(xì)胞治療后復(fù)發(fā)的臨床案例[21]。該案例報道在給1名身患B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病(B-ALL)的患者生產(chǎn)CAR-T細(xì)胞時，因分離T細(xì)胞中混有少量B淋巴瘤細(xì)胞，嵌合抗原受體基因意外地整合到B淋巴瘤細(xì)胞上，形成了“CAR-癌細(xì)胞”。癌細(xì)胞上表達(dá)的CAR與癌細(xì)胞表面的CD19結(jié)合，導(dǎo)致CD19無法被CAR-T細(xì)胞。由于“CAR-癌細(xì)胞”大量增殖，該患者最終死于與白血病相關(guān)的并發(fā)癥。

以上2例報道表明亟需尋找更為安全的傳輸系統(tǒng)用于CAR-T臨床治療中。目前主要有2個思路進(jìn)行解決，一則使用無法整合宿主細(xì)胞而具有更高安全性的腺病毒載體，同時目前針對腺病毒載體的靶向性改造技術(shù)已經(jīng)成熟(通過靶向性改造介導(dǎo)CAR基因在各種T細(xì)胞亞群中表達(dá))。由于其介導(dǎo)CAR僅在T細(xì)胞中瞬時表達(dá)，可能會減弱其長期抗腫瘤能力，但是目前已證實CAR瞬時表達(dá)的T細(xì)胞通過多次回輸可達(dá)到良好抗腫瘤效果[22]。二則可以使用非病毒載體。Stephan等成功研發(fā)了具有生物降解功能的納米顆粒，其可實現(xiàn)CAR基因的體內(nèi)轉(zhuǎn)染，相比較傳統(tǒng)的CAR-T制備過程，該方法要顯得更為簡單安全[23]。

AR-T細(xì)胞療法已在血液腫瘤治療領(lǐng)域取得了突破性進(jìn)展，如何提高CAR-T細(xì)胞療法針對實體腫瘤的治療效果仍是目前的一個難點。然而在治療過程中產(chǎn)生的毒副作用也是CAR-T細(xì)胞療法在腫瘤臨床治療中需要克服的難點，因此科學(xué)家們在提高CAR-T細(xì)胞療法有效性同時也對其臨床安全性進(jìn)行了研究與優(yōu)化。本文針對CAR-T細(xì)胞療法可能出現(xiàn)的毒副作用，總結(jié)了近年來研究人員針對提高CAR-T細(xì)胞療法安全性方面取得的成果。相信在不久的將來，隨著 CAR-T 細(xì)胞技術(shù)的不斷優(yōu)化，脫靶效應(yīng)及其他毒副反應(yīng)的發(fā)生率不斷降低，必將為越來越多的腫瘤患者帶來福音。