盧怡潔，秦 珊，秦 波

0引言

年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration，ARMD)是在全球范圍內(nèi)造成失明的主要原因之一，預(yù)計(jì)到2020年，將會(huì)有1.96億的患者罹患ARMD，而其中1 100萬(wàn)患者將會(huì)有嚴(yán)重的視力喪失，這對(duì)患者的生活質(zhì)量有著巨大的影響[1]。ARMD主要分為兩類，萎縮性和滲出性，其中滲出性ARMD約占總ARMD患者的10%。目前對(duì)于萎縮性ARMD缺乏有效的治療方法。而對(duì)于滲出性ARMD，眼內(nèi)注射抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(anti-vascular endothelial growth factor，anti-VEGF)已成為常用的治療方法。但是抗VEGF治療所針對(duì)的患者類型十分有限，且該治療也有其局限性[2-3]。RPE細(xì)胞為有色素的六角形極化單層細(xì)胞，在視網(wǎng)膜穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[4]。在萎縮性ARMD的晚期，視力喪失主要是由于RPE以及光感受器細(xì)胞萎縮導(dǎo)致的脈絡(luò)膜毛細(xì)血管繼發(fā)性喪失引起的。這提示我們需要引入替代細(xì)胞和/或營(yíng)養(yǎng)因子來(lái)重建視網(wǎng)膜解剖結(jié)構(gòu)。近幾年來(lái)，隨著再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的不斷發(fā)展，使得干細(xì)胞移植成為了最具潛力的有望治療ARMD的方法。目前的干細(xì)胞來(lái)源主要為兩類，胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell，ESC)和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cell，iPSC)。目前ESC來(lái)源的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(retinal pigment epithelium，RPE)已被證實(shí)可以在視網(wǎng)膜退行性病變的動(dòng)物模型中移植并且發(fā)揮功能[5]，然而ESC來(lái)源的干細(xì)胞難以回避道德和倫理問(wèn)題，并且存在免疫排斥和來(lái)源不足的問(wèn)題。iPSC的出現(xiàn)為干細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域帶來(lái)了新的轉(zhuǎn)變，提供了多能細(xì)胞的替代來(lái)源。本綜述將在ARMD的背景下論述關(guān)于iPSC細(xì)胞的相關(guān)研究以及持續(xù)存在的挑戰(zhàn)。

1誘導(dǎo)多能干細(xì)胞及其衍生的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞

最初，iPSC是由Yamanaka等將4種轉(zhuǎn)錄因子Oct4、Sox2、Klf4和c-myc通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)入小鼠皮膚成纖維細(xì)胞所得[6]。這些“重編程”的細(xì)胞具有分化為體內(nèi)任何細(xì)胞的能力，同時(shí)避免了道德和倫理方面的相關(guān)問(wèn)題，引入了使用自體細(xì)胞對(duì)患者進(jìn)行特異性療法的可能性。因?yàn)橐浦布?xì)胞來(lái)自于患者自身，原則上不引起免疫反應(yīng)，因此消除或減少了免疫抑制治療的需要。自從2006年以來(lái)，該技術(shù)已經(jīng)被用于重編程來(lái)自不同物種的體細(xì)胞，其中包括大鼠、狗、恒河猴以及人類[7-10]。眼球作為理想的干細(xì)胞移植器官，其相對(duì)于身體的其他器官處于天然的免疫豁免狀態(tài)，而且與其他器官相比，眼球的大小決定了其只需較少的細(xì)胞數(shù)量即可完成移植。iPSC-RPE細(xì)胞已經(jīng)被證實(shí)在體內(nèi)與體外都具有RPE細(xì)胞的形態(tài)和功能特征，例如表達(dá)RPE特異性標(biāo)記，如閉合小帶蛋白-1(ZO-1)，而且具有執(zhí)行關(guān)鍵功能的潛力，如與天然RPE類似的處理維生素A的能力[11]，并且可以分泌抑制免疫反應(yīng)的可溶性抑制因子，如TGF-β2、血小板反應(yīng)蛋白-1(TSP-1)等[12]。這些結(jié)果均表明，iPSC已經(jīng)能夠成功衍生出與天然RPE相似的RPE細(xì)胞，為ARMD的干細(xì)胞治療提供了基礎(chǔ)。

2誘導(dǎo)多能干細(xì)胞衍生的RPE細(xì)胞治療ARMD的臨床前研究

為了測(cè)試iPSC-RPE細(xì)胞療法的功效，許多研究者利用動(dòng)物模型進(jìn)行驗(yàn)證研究?；始彝饪漆t(yī)學(xué)院(royal college of surgeons，RCS)大鼠為最常用于檢測(cè)ARMD細(xì)胞療法的動(dòng)物模型，這種視網(wǎng)膜退行性動(dòng)物模型患有原癌基因酪氨酸激酶(MERTK)的基因突變，將會(huì)導(dǎo)致RPE和視網(wǎng)膜變性，從而破壞外節(jié)段吞噬作用[13]。研究證明，視網(wǎng)膜下腔移植來(lái)自非營(yíng)養(yǎng)不良大鼠、胎兒、新生兒和成人作為供體所衍生的iPSC-RPE細(xì)胞可不同程度地延遲RCS大鼠的疾病發(fā)作，并且可以預(yù)防或逆轉(zhuǎn)RPE的退化[14-17]。Li 等[18]將iPSC-RPE細(xì)胞注射到出生后第2d的視網(wǎng)膜變性小鼠模型(Rpe65rd12/Rpe65rd12)的一只眼的視網(wǎng)膜下空間，使用對(duì)側(cè)眼作為對(duì)照，研究顯示移植后長(zhǎng)期存活的iPSC來(lái)源的RPE與宿主原生的RPE細(xì)胞共定位，并且移植6wk后的視網(wǎng)膜電圖(electroretinogram，ERG)，即受體的視覺(jué)功能得到了改善，為應(yīng)用iPSC移植治療視網(wǎng)膜退行性變的臨床相關(guān)模型提供了功能恢復(fù)的直接證據(jù)。同時(shí)該試驗(yàn)進(jìn)行了長(zhǎng)達(dá)6mo的隨訪研究，顯示在任何移植的小鼠中均未檢測(cè)到畸胎瘤，表明了iPSC-RPE的安全性和有效性。Sun等[19]則將iPSC-RPE細(xì)胞注射到免疫抑制的視網(wǎng)膜色素變性模型rd1小鼠的視網(wǎng)膜下空間，發(fā)現(xiàn)人iPSC-RPE細(xì)胞在術(shù)后第14d和第21d明顯減輕了小鼠的光感受器變性，延遲了光感受器退化。Kamao等[20]將來(lái)自于非人靈長(zhǎng)類食蟹猴自體誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞進(jìn)行自體移植，證實(shí)移植后iPSC-RPE細(xì)胞片沒(méi)有出現(xiàn)免疫排斥或腫瘤形成，表明了iPSC-RPE細(xì)胞片可作為一種有效的移植形式用于組織替代治療ARMD。當(dāng)然，這種視力挽救是由于替換的RPE細(xì)胞還是由于植入的RPE細(xì)胞所分泌的生長(zhǎng)因子所起的旁分泌作用仍有待確定，但是小型、大型的動(dòng)物模型的諸多實(shí)驗(yàn)結(jié)果為iPSC細(xì)胞進(jìn)入人體試驗(yàn)研究鋪平了道路。

3基于iPSC的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞移植的臨床研究

目前使用iPSC衍生的RPE細(xì)胞片進(jìn)行臨床試驗(yàn)的研究非常有限。日本Riken發(fā)育生物學(xué)中心報(bào)道了第1個(gè)也是唯一一個(gè)接受iPSC-RPE細(xì)胞片視網(wǎng)膜下移植患者的臨床報(bào)告。2014-09，1例患有滲出性黃斑變性(息肉狀脈絡(luò)膜血管病變)的日本女性患者在視網(wǎng)膜下腔植入了由自身成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的iPSC衍生的RPE細(xì)胞片?；颊呶唇邮苊庖咭种浦委?，在移植后1a的時(shí)間點(diǎn)沒(méi)有出現(xiàn)不良反應(yīng)，且移植的細(xì)胞保持完整，視力未再出現(xiàn)下降，光學(xué)相干斷層掃描(OCT)顯示移植部位出現(xiàn)高密度區(qū)域，提示感光細(xì)胞內(nèi)部以及外部區(qū)段的恢復(fù)可能。但在2015-03該試驗(yàn)被用于第2例患者時(shí)，由于發(fā)現(xiàn)了iPSC中的遺傳突變，該試驗(yàn)被迫擱置[21-23]。雖然尚不清楚這些遺傳突變是來(lái)自于重編程中的誘導(dǎo)還是來(lái)源于患者的體細(xì)胞，但是這也提示我們?cè)谶M(jìn)入人體試驗(yàn)之前必須評(píng)估基因組的穩(wěn)定性。為了避免來(lái)自于個(gè)體的基因組異常的可能性，Sugita等使用來(lái)自部分匹配供體的iPSC，這些細(xì)胞不僅可以驗(yàn)證基因組的穩(wěn)定性，同時(shí)還可以加速細(xì)胞生產(chǎn)過(guò)程。他們的研究成果證明，來(lái)自主要組織相容性復(fù)合物(major histocompatibility complex，MHC)純合子供體的細(xì)胞可以用于組織相容性受體視網(wǎng)膜疾病的治療。在該研究中，研究人員將來(lái)自于MHC純合動(dòng)物的iPSC衍生的RPE細(xì)胞移植到?jīng)]有免疫抑制的MHC匹配的動(dòng)物模型中，發(fā)現(xiàn)iPSC衍生的RPE同種異體移植物未出現(xiàn)免疫應(yīng)答或排斥。這些研究表明，如果供體是MHC或者HLA匹配，iPSC衍生的RPE細(xì)胞同種異體移植可能是成功的，且?guī)缀鯖](méi)有免疫抑制[24-25]。Sugita等所提出的同種異體HLA匹配的干細(xì)胞治療方法為自體iPSC提供了替代方案，也更豐富了ARMD相關(guān)的細(xì)胞治療思路。

4基于iPSC的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞移植所面臨的挑戰(zhàn)

基于iPSC治療的首先需要面對(duì)的問(wèn)題就是其耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)和昂貴的費(fèi)用，特別是對(duì)于自體來(lái)源細(xì)胞的移植治療。據(jù)估計(jì)，自體來(lái)源細(xì)胞治療的制備需要3mo才能完成，從采集到眼內(nèi)植入大約需要花費(fèi)100萬(wàn)美元[26]。同種異體HLA匹配細(xì)胞的使用可能更為有效、經(jīng)濟(jì)，同時(shí)也適合大批量生產(chǎn)使用。

其次就是移植后的致瘤性和安全性方面的考慮，iPSCs的發(fā)育需要重編程體細(xì)胞，方法包括通過(guò)病毒轉(zhuǎn)染或者化學(xué)誘導(dǎo)等將外源轉(zhuǎn)錄因子傳遞到細(xì)胞中[27]，病毒載體可以是整合或者非整合的，因此具有突變或者免疫原性的可能[28]。雖然Kanemura等[29]研究證明，在嚙齒動(dòng)物模型中iPSC衍生的RPE細(xì)胞的致瘤性是可以忽略不計(jì)的，但是還需要更多的體內(nèi)研究來(lái)進(jìn)一步佐證。而在遺傳性視網(wǎng)膜疾病中，引起疾病的突變?nèi)杂锌赡艽嬖谟趇PSC衍生的細(xì)胞中，因此如何利用基因編輯技術(shù)修復(fù)存在的遺傳缺陷并制造健康的細(xì)胞也是面臨的問(wèn)題之一。此外iPSCs移植的長(zhǎng)期安全性也未可知，迄今的動(dòng)物研究最長(zhǎng)觀察時(shí)間為6～9mo，因此尚不清楚其長(zhǎng)期的致瘤性。另一亟待解決的安全性挑戰(zhàn)便是自體來(lái)源和異體來(lái)源干細(xì)胞衍生的RPE細(xì)胞的免疫反應(yīng)。

所有基于細(xì)胞治療干預(yù)措施的主要挑戰(zhàn)為確保細(xì)胞能夠整合到宿主視網(wǎng)膜中，即移植的細(xì)胞必須整合到現(xiàn)有的神經(jīng)回路中發(fā)揮正常功能。Zhong等[30]發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的人類iPSCs再現(xiàn)了體內(nèi)視網(wǎng)膜發(fā)育的主要過(guò)程，形成了包含主要視網(wǎng)膜細(xì)胞類型的3D視網(wǎng)膜杯，并顯示出視網(wǎng)膜外節(jié)盤的形成和光敏性。Lamba等[31]同樣觀察到來(lái)源于iPSCs的光感受器細(xì)胞移植入視網(wǎng)膜下腔空間后不僅能夠存活，并且在視網(wǎng)膜外核層發(fā)現(xiàn)了移植細(xì)胞，這表明iPSCs具有遷移并整合于視網(wǎng)膜的能力。盡管在動(dòng)物模型中取得了成功，但是如何增加移植細(xì)胞與宿主視網(wǎng)膜整合能力又是一個(gè)新的挑戰(zhàn)。干細(xì)胞移植方法的選擇與生物材料的改進(jìn)，決定了移植細(xì)胞能否長(zhǎng)期存活以及是否發(fā)揮作用。目前，將細(xì)胞遞送到視網(wǎng)膜下空間主要有兩種方法，一種為將干細(xì)胞衍生的RPE懸浮液注射到視網(wǎng)膜下空間；另一種則是將干細(xì)胞衍生的RPE細(xì)胞接種于支持膜(可生物降解和/或具有生物相容性的支架或生物膜)上形成單層的RPE細(xì)胞片進(jìn)行移植。鑒于晚期ARMD患者Bruch膜的異常程度，與單個(gè)RPE細(xì)胞懸液視網(wǎng)膜下注射相比，具有支撐層的RPE細(xì)胞移植片被認(rèn)為更有效。目前研究人員已經(jīng)集中開(kāi)發(fā)不同材質(zhì)的生物材料聚合物支架，如膠原凝膠、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)支架、聚酰亞胺膜、血漿聚合物、聚對(duì)二甲苯-C膜、聚酯膜、聚酰胺納米支架[20, 32-37]等，這些聚合物與Bruch膜作用相似，可以為RPE提供支持與營(yíng)養(yǎng)，同時(shí)可以設(shè)計(jì)具有特定的特性，例如特定的降解速率[38]。

iPSC衍生的RPE細(xì)胞理論上是可以替代在ARMD中受損的RPE細(xì)胞，但是實(shí)際移植的RPE細(xì)胞能夠發(fā)揮多少功能，能否替代原來(lái)的RPE細(xì)胞所必須的基本功能以減緩甚至逆轉(zhuǎn)疾病的進(jìn)展還有待觀察。而且即使移植的RPE細(xì)胞能發(fā)揮正常的生理功能，其在ARMD病理環(huán)境中能否成功移植以及長(zhǎng)期存活都需要進(jìn)一步的研究來(lái)探討。

5展望

iPSC在治療ARMD中有巨大的潛力，但仍存在必須要跨越的障礙。通過(guò)iPSCs的培養(yǎng)和疾病建模，讓我們對(duì)視網(wǎng)膜變性疾病領(lǐng)域有了更新的理解。而在未來(lái)的應(yīng)用中，更重要的是優(yōu)化重編程方法，開(kāi)發(fā)高效的分離、分化方法，改進(jìn)干細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞注入患者的方法，例如使用支架或者生物膜等支持材料，同時(shí)測(cè)試安全性和完整性，并能監(jiān)測(cè)移植后細(xì)胞的長(zhǎng)期存活情況。